基于代谢组学方法的栀子化学型形成机制的研究

本课题采用新型常压解吸化学电离质谱技术，对栀子花挥发性代谢产物进行实时活体分析，研究栀子在不同条件下花器官挥发物的动态释放行为；同时以栀子果为研究对象，采用液相色谱电喷雾串联质谱分析技术，研究其活性成分如栀子苷、熊果酸、藏花素等含量与环境条件变化的关系；然后结合生化分析手段，研究栀子花和果实中有关萜类合成酶的活性，为全面揭示栀子化学型的形成机制提供实验依据。实验总体设计和数据处理方法采用代谢组学研究思路，侧重于探索栀子在不同条件下的生物标志物或特征模式，同时也关注一些经济价值较高的活性成分含量的变化。前期研究表明，常压解吸化学电离质谱可以实现生物样品的实时活体分析，该技术不对样品造成破环，在生物体内生理活动化学本质规律的研究方面有较大的优势。江西是栀子主产区和"道地药材"产地，由于土壤、气候等因素的改变，其品质必然受影响，开展本项目的研究对地区特色经济的发展有较大的实际意义。

研究结果主要包括三个方面，一是设计并制作了解吸常压化学电离质谱（DAPCI-MS）用于植物活体样品直接分析的接口，对获得的质谱信号进行了优化。结果表明，喷雾电压为3300V，离子传输管电压为40V，毛细管电压为25V，毛细管温度为100℃，此时栀子花挥发性代谢产物信号（总离子流）强度相对最大。二是栀子花方面的研究。将DAPCI-MS应用于栀子花挥发性代谢产物的活体分析，研究其动态变化规律及化学型的差异。采用DAPCI-MS记录栀子花挥发物的质谱图，结果可以检测到较强的茉莉内酯、罗勒烯、金合欢烯、惕各酸己烯酯和叶醇等信号。DAPCI-MS测定速度快，单个样品的测定时间仅为10-20s，加上样品切换时间，平均每个样品检测费时不到1min，表明DAPCI-MS适合样品的高通量快速分析。我们对栀子及其3个变种的花卉挥发物进行了测定，并对12个样本32个变量进行主成分分析及聚类分析，结果表明，以本实验条件下测得数据为依据，山栀子与雀舌栀子的亲缘关系最近，山栀子与大花栀子的亲缘关系最远，这一结果与葛菲等人从基因层面研究的结果有所不同。栀子花花瓣β-葡萄糖苷酶活力在开花后第1天到第5天表现增强趋势，与罗勒烯和茉莉内酯信号强度有一定的相关性。三是栀子果实方面的研究。研究了温度、光照条件对栀子果实活性成分的影响，包括栀子苷、西红花苷I和II、京尼平苷酸、京尼平、西红花酸、熊果酸、绿原酸8种主要成分，建立其分析方法，研究采收时间、环境因子等对栀子主要活性成分含量的影响。结果表明，京尼平苷等8种栀子主要活性成分进样量在一定范围内峰面积与进样量表现出良好的线性关系，R2值在0.9991到0.9997之间。栀子鲜果形态及化学成分与温度、光照有较大关系，在一定范围内年平均气温和光照强度增高，栀子鲜果粒重、粒长和粒径均明显增大，气温和光照强度的增高也有利于京尼平苷和西红花苷化合物的合成，但是除京尼平苷之外的其他环烯醚萜类化合物及绿原酸的含量与光照强度无明显的相关性。采用三波长高效液相色谱法测定了3种不同强度光照条件下得到的9个栀子样本，以HPLC保留时间为变量，将各保留时间的峰面积数据进行主成分分析，结果9个样本按光照强度的不同基本被分成3类。近十几年，我省栀子种植业得到快速发展，选育的品种也非常适合在酸性红壤土中生长，鲜果亩产量远高于国内其他地区，但是由于当地年平均气温及日照强度对于栀子活性成