基于双乳化液滴的单细胞芯片用于葡萄糖微环境调控T细胞肿瘤杀伤功能的研究

The lack of glucose in tumor microenvironment causes the abnormal metabolism of T cells, which is an important inducement of T cell functional exhaustion relating to the immune evasion of tumors. Real-time analysis of the glucose regulation on the heterogeneous tumoricidal functions of single T cells helps to reveal the metabolic mechanism of T cell exhaustion, screen corresponding drugs and develop new immunotherapies. Microfluidics, which enables precise manipulation of a trace of liquid, has unique advantages in single-cell analysis. Herein, we propose to fabricate a microfluidic chip to investigate the ability of cytokine secretion and tumoricidal function of single T cells under different glucose concentrations. These cells are encapsulated inside water-in-oil-in-water double emulsions which enable mass transfer between their inner and outer phases to modulate the glucose concentration in a real-time manner. Moreover, thapsigargin, a Ca2+-ATPase inhibitor is employed to demonstrate the potential of this microfluidic platform for applications of drug screen toward T cell metabolism-related signal pathways. This proposal will benefit the development of immuno-therapeutic drugs which need in vitro models mimicking the aqueous tumor microenvironment.

肿瘤微环境中葡萄糖的匮乏会造成T细胞糖代谢异常，是其功能性耗竭的重要代谢因素，与肿瘤免疫逃逸密切相关。以单细胞精度明确T细胞个体对于葡萄糖微环境变化的实时响应的异质性特征及时间轴，有助于更加深入和准确地揭示葡萄糖微环境对于T细胞功能的调控，为肿瘤免疫精准治疗开发针对性的药物或提供新的治疗策略。由于工作尺度与细胞高度契合，可精确操控微量液体的微流控芯片在单细胞分析中有独到优势。本项目拟基于前期搭建的芯片平台，利用双乳化液滴内外水相能进行物质交换的特点，构建葡萄糖浓度可实时调控的液滴微环境，检测液滴内水相中的T细胞在不同葡萄糖浓度下功能性细胞因子的分泌及共存的肿瘤细胞的活性，在单细胞层面研究葡萄糖微环境的实时变化对T细胞肿瘤杀伤功能的调控。同时以针对糖代谢相关信号通路的毒胡萝卜素thapsigargin为例，验证该芯片可用于在细胞层面评估相关小分子药物的效果。

细胞在许多生命活动和疾病进展中都有重要作用，在单细胞层面开展相关研究有助于进一步阐明特定生命活动的规律、揭示某些疾病发生与发展的机制。微流控芯片技术作为一种精确操控微量液体的新兴技术，在单细胞研究中具有巨大优势。利用在芯片中形成的微液滴或者直接构造的微腔室，我们可以以单细胞方式观察细胞的生长增殖并分析其分泌物、基因组、转录组等。如何利用微流控芯片对单个细胞开展可定位的培养与分析，进而研究细胞在特定生命活动或者疾病进展中的功能和作用，一直是当前研究的热点。本项目在项目团队前期微流控芯片技术和单细胞分析方面工作的基础上，开展了一系列基于微流控芯片的单细胞分析相关研究，主要包括以下内容：1、结合双乳化液滴芯片流体参数的理论分析，构建了双乳化液滴高通量生成和锚定的芯片体系，优化了双乳化液滴芯片的表面改性工艺提高了亲水效果，增强液滴稳定性并减小了液滴之间的相互干扰。2、搭建了可大量存储双乳化液滴并能够调节其所处液体环境的微流控芯片体系。3、实现了液滴所处液体环境的内容物浓度精确实时调控，并建立基于颜色图像分析的溶液浓度测定方法，探究了双乳化液滴内外相溶液进行离子交换情况，分析了内外相溶液成分对于双乳化液滴中单细胞的活性和增殖情况的影响。4、通过在芯片中微孔阵列中嫁接特异性抗体，结合免疫夹心反应以及泊松分布计算，实现了高精度检测蛋白分子浓度，为在芯片中检测细胞分泌的蛋白、细胞因子等提供了检测手段。5、基于开发的微流控系统，分析了不同浓度的药物对于肿瘤细胞的杀伤作用，验证了通过微流控芯片平台可以通过调控细胞所处液体微环境，实时监测细胞对于环境内容物的响应情况。本项目的研究能够为基于微流控芯片和液滴技术的单细胞生长增殖、分泌物检测、环境刺激响应等方面的研究提供一种新的思路和工具，从而有助于特殊细胞相关的诸如肿瘤耐药等发生发展过程并找到相应的治疗策略。