Rap1GAP抑制恶性黑色素瘤血管形成作用机制的探讨

血管形成是恶性黑色素瘤（Malignant melanoma，MM）生长及转移的病理基础和重要条件，如何抑制MM血管形成是目前亟待突破的关键问题。申报者在原有Rap1GAP抑制MM细胞作用研究的基础上，进一步发现Rap1GAP过表达抑制MM细胞VEGF和bFGF表达以及外源性VEGF诱导的MM内皮细胞移行和Rap1活性;MM内皮细胞Rap1GAP表达降低，基因启动子过甲基化,类毛细血管形成增加;抗TGF-beta抗体或DNA甲基转移酶抑制剂使沉默的MM内皮细胞Rap1GAP重新表达，从而抑制该细胞移行。据此，申报者推测，Rap1GAP及其基因启动子甲基化对MM血管形成的作用是影响MM生长和转移的重要因素。本课题将延伸申报者前期实验，对此作进一步深入研究，从而为深入阐明和理解Rap1GAP作为可能的抑癌基因在MM生长及转移中的作用及其机制，为设计以Rap1GAP为靶标的治疗策略提供理论依据。

一．项目的完成情况.通过研究小组三年时间的合作与努力工作，本课题研究内容已基本完成，已发表SCI文章1篇，另有三篇已分别投寄相应期刊，同时还在整理、完善、分析其它资料用于文章发表。 .二.成果 .研究内容紧密围绕课题研究要点进行，探讨Rap1GAP抑制恶性黑色素瘤（MM）组织中血管新生及其机制，肿瘤微环境对MM内皮细胞生物学行为以及Rap1GAP表达的影响。结果显示：1. 在人脐静脉内皮细胞（HUVEC），Rap1GAP过表达抑制ERK磷酸化和Akt磷酸化以及细胞增生和迁移，并通过ERK和/或Akt途径抑制VEGF诱导的HUVEC增生； 2. 在MM细胞，Rap1GAP过表达抑制VEGF表达，并通过抑制ERK磷酸化，抑制Rap1特异性激动剂，8CPT-2’OMe-cAMP，诱导的VEGF表达；并通过抑制Akt磷酸化，抑制8CPT-2’OMe-cAMP诱导的bFGF表达，表明Rap1GAP通过ERK信号途径抑制VEGF表达以及通过Akt信号途径抑制bFGF表达；3. 外源性的VEGF诱导MM细胞增生和迁移。ERK抑制剂， PD98059或PI3K 抑制剂，LY294002，阻断了VEGF的这一作用，与Rap1GAP转染后Rap1GAP过表达抑制VEGF诱导的Rap1GTP，ERK磷酸化和Akt磷酸化，降低VEGF诱导的MM细胞增生和迁移的作用类似。此外，Rap1GAP过表达还增加VEGF抑制的促细胞凋亡蛋白caspase3和caspase9表达，抑制VEGF诱导的细胞周期蛋白，cycling D1表达，以及VEGF诱导的基质金属蛋白酶-2和-9的活性；4. 在体内，Rap1GAP通过抑制VEGF和/或bFGF的表达，使MM组织中内皮细胞增生降低，微血管密度减少，从而抑制MM生长；5. 与正常黑色素细胞比较，MM细胞合成、分泌TGF-β增加，而TGF-β刺激MM内皮细胞（MMEC） DNA甲基化转移酶表达，增加Rap1GAP启动子甲基化，使Rap1GAP表达减少，促进MMEC增生和迁移；此外，Rap1GAP过表达通过抑制Akt磷酸化, 抑制MMEC表达VEGF和bFGF。.总之，我们的结果证实，Rap1GAP抑制MM血管新生，为深入理解Rap1GAP作为抑癌基因，抑制MM生长和转移的作用机理，为设计以Rap1GAP为靶标的MM治疗策略进一步提供了理论依据。.