共表达分析及内生菌转录组比对结合VIGS技术实现喜树碱合成途径的快速解析

Camptotheca acuminata is a traditional Chinese medicinal plant, which is the major resource for camptothecin (CPT), a very effective anti-cancer drug. The accumulation of CPT in C. acuminata is very low, that limited its application in clinical therapy. To meet the requirement of CPT in the market, it’s important to effectively regulate the biosynthesis of CPT and promote its production in plants, which led to urgent need for CPT biosynthesis pathway elucidation. Since all downstream genes for CPT biosynthesis were not cloned and the related intermediate compounds were unclear, it’s hard to use traditional methods for unknown pathway gene cloning. In order to reveal CPT biosynthesis pathway, it’s necessary to develop an effective approach for both candidate gene screening and functional identification. In this project, we are going to use co-expression analysis and endophytes transcriptome analysis for candidate pathway genes screening, and then adopt virus-induced gene silencing (VIGS) combining HPLC-MS/MS analysis for functional identification of candidate pathway genes and confirmation of molecular structure of intermediate compounds. After further verification of these confirmed new pathway genes by enzyme assay or biotransformation, we hopefully clone missing pathway genes and accomplish CPT biosynthesis pathway.

喜树作为中国传统珍贵的药用植物，是高效抗肿瘤药物喜树碱的主要来源。但和绝大多数药用植物中次生代谢物的积累量相类似，喜树中喜树碱含量却很低，无法满足市场的需求。为了有效地调控代谢通路、促进喜树碱的合成，揭示喜树碱的合成途径便显得尤为重要。由于在异胡豆苷之后所有的喜树碱下游合成途径酶基因均未被克隆，同时中间代谢产物尚不清楚，这为喜树碱合成途径的解析带来了很大的难度。为了实现对喜树碱下游合成途径未知酶基因的克隆，确定相应酶基因的底物即喜树碱合成途径中间代谢产物的分子结构，完成代谢途径的解析，设计出一套快速、高通量的基因筛选及功能鉴定体系便显得尤为重要。本项目拟从共表达分析及内生真菌转录组比对两条路线出发，实现对候选酶基因的高通量筛选，进而通过VIGS技术结合HPLC-MS/MS实现对候选酶基因功能的快速鉴定及中间代谢产物的结构确定，完成喜树碱合成代谢途径解析，为喜树碱合成的代谢调控提供理论依据。

喜树作为中国传统珍贵的药用植物，是高效抗肿瘤药物喜树碱(Camptothecin，CPT)的主要来源。由于在植物中喜树碱积累量较低，且生物合成途径较为复杂，为了有效地调控其次生代谢通路以促进CPT的合成，揭示喜树碱的合成途径便显得尤为重要。本项目主要通过共表达分析及转录组数据库比对等技术手段，对喜树碱代谢途径中CaCPRs，CaSLSs等目的基因进行筛选，再利用VIGS沉默技术和酵母异源表达及酶反应实验、基因过表达分析等对候选酶基因进行快速、有效的功能鉴定；经HPLC-MS/MS等技术分析代谢途径中间代谢产物，最终完成了喜树碱生物合成途径关键代谢步骤的解析。项目针对喜树碱代谢途径合成酶基因功能及中间代谢产物，全面地进行了转录组学、分子生物学、生物化学、酶学以及分析化学的研究。主要研究内容和成果如下：(1)利用所构建的转录组数据库，通过共表达分析完成了对喜树碱合成途径CaCPRs，CaSLSs等候选酶基因和CaLMF等调控基因的快速筛选；(2)利用代谢物非靶标分析技术系统完成了喜树碱生物合成途径Secologain acid等重要中间代谢产物的分析检测；(3)喜树中CaCYC酶基因、细胞色素P450单加氧酶CaSLSs及还原酶CaCPRs等关键酶基因的克隆与功能鉴定；(4)喜树碱生物合成重要调控蛋白bZIP转录因子CaLMF, WRKY家族转录因子CaWRKY1-2等基因的克隆及功能分析鉴定；(5)整合功能确定的代谢途径合成酶基因及中间代谢产物谱图，对喜树碱合成途径进行阐述解析。(6)发表学术期刊论文20篇，其中SCI收录论文13篇，中文CSCD和核心期刊论文共6篇；授权专利4项，申请专利1项；(7)培养博士研究生3名、硕士研究生13名，指导本科生国家级和省级创新实践项目5项；(8)承办国际会议1次，参加国内外学术会议10人次。项目研究成果不仅为植物次生代谢物合成酶基因及调控基因功能鉴定提供系统性研究方法和理论依据，同时也为合成生物学在喜树碱合成上的应用提供必要的理论基础和基因元件。