VEGF-A cmRNA对糖尿病性骨质疏松骨再生的作用及机制研究

To explore the effects and mechanisms of VEGF-A cmRNA on promoting osteogenesis after diabetic osteoporosis, we will use the cell models of directed osteogenic differentiation/adipogenic differentiation of human mesenchymal stem cells(hMSCs) in vitro, then use animal models of diabetic osteoporosis in vivo. First we need to make VEGF-A cmRNA. In vitro study to confirm VEGF-A cmRNA on the condition of high glucose contribution osteogenic differentiation and inhibition of adipogenic differentiation by detecting specific gene expression of osteogenic/adipogenic and phenotype of osteoblasts/adipocyte，after overexpression of VEGF-A through graded importing VEGF-A cmRNA or transfecting CRISPR-Cas9 to knockout VEGF-A gene. In vivo, we will make mouse model of diabetic osteoporosis, then inject VEGF-A cmRNA. After injection of VEGF-A cmRNA for 4, 8 and 12 weeks, we will detect bone histomorphometry, bone ultrastructure, bone mineral density and specific gene expression. At last to observe the effect of VEGF-A cmRNA on promoting osteogenic differentiation and inhibition of adipogenic differentiation, in vivo to further confirm VEGF-A cmRNA promoting on bone regeneration and angiogenesis in diabetic osteoporosis rat. Our aim is to provide new idea and new method for the treatment of diabetic osteoporosis.

以hMSCs成骨和成脂定向诱导细胞分化模型和糖尿病性骨质疏松大鼠模型为研究对象，沿着VEGF-A平衡调控高糖下成骨和成脂分化和增加血管生成的思路，朝着VEGF-A cmRNA促进糖尿病性骨质疏松骨再生的目标开展工作。体外通过转染VEGF-A cmRNA或CRISPR-Cas9上下调VEGF-A表达，应用细胞分化表型特征与特异基因相结合的方法，分析各组不同时点成骨和成脂分化能力，探讨VEGF-A平衡调控高糖作用后hMSCs成骨和成脂分化机制。体内利用分次注射VEGF-A cmRNA促使病损区脉冲表达VEGF-A，在4、8和12周后，使用骨形态计量、显微CT、超微结构分析和检测分化特异基因等定性定量方法评价骨再生效能及检测血管生成，证实VEGF-A cmRNA借助脉冲表达VEGF-A的方式增强成骨同时抑制成脂和增加血管生成，促进糖尿病性骨质疏松病损区骨再生，为糖尿病性骨质疏松的治疗提供新思路。

目的：本研究以hMSCs成骨和成脂细胞定向分化和糖尿病性骨质疏松症大鼠模型为研究对象，从体内（外）两个研究层面探讨VEGF-A cmRNA促进糖尿病骨质疏松骨再生的机制。方法：在体外研究中采取hMSCs成骨和成脂定向诱导的方法构建细胞分化模型，分别采用脉冲式导入VEGF-A cmRNA上调VEGF-A的表达，在高糖培养下探讨VEGF-A平衡调控hMSCs成骨和成脂细胞定向分化的作用机制。结果：1、成功构建体外转录模板和人工合成修饰 VEGF-A cmRNA。2、确认了VEGF165 cmRNA 高效率转染 hMSCs（原代细胞）的方法。3、明确 VEGF-A cmRNA 最优转染剂量为 250ng/2ml。4、多次转染VEGF-A cmRNA实现脉冲表达VEGF-A方法可行。5、在调控成骨和成脂定向分化体外研究中，采用无血清培养及诱导体系更为合理。6、采用 B18R 蛋白预处理，阳离子转染剂（Stemfect™ RNA Transfection kit Cat#00-0069）转染，转染效率达 95%以上。7、证实 VEGF165 cmRNA 转染剂量＞25ng/2ml与hMSCs成活（增殖）呈负相关。8、多次转染 VEGFA165 cmRNA 实现脉冲表达VEGF-A方法可行。9、证实有血清培养 hMSCs 流式检测人白细胞 DR 抗原（HLA-DR）阳性率＞30%，CD90 分为弱阳性及阳性两群；无血清 HLA-DR 阳性率＜1%，CD90+＞98%；有无血清培养 hMSCs 流式检测 CD 11b、19、34、45、73、105 无差别。10、证实 hMSCs 有血清成骨/成脂诱导体系，影响成骨分化标志基因表达趋势，虽不影响成脂分化标记基因表达趋势，但使标记基因表达峰值后移。11、在调控成骨和成脂定向分化体外研究中，采用无血清培养及诱导体系更为合理。结论：为证实VEGF-A cmRNA借助脉冲表达VEGF-A的方式增强成骨同时抑制成脂和增加血管生成，促进糖尿病性骨质疏松病损区骨再生奠定初步基础，后续为糖尿病性骨质疏松的治疗提供新思路。