酵母木糖代谢关键基因的筛选与分子机制探索

木糖的高效乙醇发酵是木质纤维原料生物转化制取燃料乙醇商业化生产的基础，现有的天然酵母及工程菌的木糖发酵生产性能均不能满足工业生产的要求，严重制约了该技术的发展，开展木糖代谢分子机制的研究对于选育和开发性能优良的酵母生产菌株具有重要的理论指导和现实意义。本项目以模式酵母菌休哈塔假丝酵母C. shehatae为研究材料，采用SSH技术首次构建酵母木糖代谢的正、反向消减cDNA文库，测定、比对和分析差异性基因的EST序列，结合基因组芯片和RT-PCR筛选出酵母木糖代谢的关键基因，表达和分析新基因的功能，在此基础上重构酵母木糖代谢途径并探索分子机制。该研究成果具有普遍的指导意义，可以为木糖发酵的菌种改良和工艺研究提供理论指导，为木质纤维原料的高效生物转化和加工奠定理论基础。

采用高通量测序技术Roche 454（GS FLX Titanium System）首次同步测定了模式酵母菌株C. shehatae ATCC 22984木糖、葡萄糖发酵的de novo转录组EST，分别得到木糖、葡萄糖发酵体系各60万条reads（测序长度400bp），转录组测序深度超过40×，测序数据提交NCBI（SRA053160）。拼接得到木糖7250条和葡萄糖7168条Contig，以BLAST分别对其中2421个和2456个Contig进行了功能注释和GO分类。通过2个转录组间的大规模序列对比分析共发现158个差异表达基因（p﹤0.05），其中木糖和葡萄糖体系分别占74个和84个。结合ST、EMP、PPP、TCA和乙醇发酵代谢途径的多尺度解析，筛选出显著性差异转录基因15个，经RQ-PCR验证确定XYL1、XYL2、GDH2、PFK、TDH、GPM、HXK和GLK受木糖诱导，PCK、LAD、ICL、ALD、MDH、UGA2和UGA22受葡萄糖诱导，由此构建得到C. shehatae木糖乙醇发酵的特征转录谱。通过与近缘菌株C. tropicalis比较发现，在木糖代谢酵母中PDH、TKL、PYK、PDC、XDH、XYL和HAGT基因属木糖诱导转录，而SDH和ALDH基因属葡萄糖诱导转录。酵母发酵木糖产乙醇的关键性代谢瓶颈主要存在于细胞转录水平调控，至少需要提高STP、HATP、ADH、PCK和LAD基因的转录，同时抑制ALDH基因转录。基于转录组研究筛选出42个与抑制物响应的目标基因，经RQ-PCR分析确定受甲酸显著抑制的基因10个：XYL2、ACS、RKI、TAL、GND1、TKL、ZWF1、XYL1、PDH和PDC，上调基因5个：ALD、GLK、MDH、PFK和ADH，在此基础上结合代谢途径探索了甲酸抑制的分子及生化机制。针对现有木质纤维原料预处理及木糖乙醇发酵技术的不足，结合本项目的部分研究成果基于系统论的观点首次提出新型稀酸—磨浆原料预处理技术，建立了低聚糖类、糖醛酸和糖酸类等中间产物同步精确定量测定的色谱方法，提出了减压蒸发浓缩与石灰乳中和相结合的联合脱毒方法，有效地提高木糖液的发酵生产性能。研究成果可为木质纤维原料生物炼制，尤其是木糖发酵酵母的分子生物学、遗传改良和发酵工艺研究提供借鉴和指导。