雪松松针中新型抗菌剂CHQA对食源性致病菌的抑制作用与分子机制的研究

Foodborne diseases are a growing public health problem worldwide. The main reason is due to ingestion of foodstuffs contaminated with microorganisms and the contamination of food may occur at any stage in the process from food production to consumption (“farm to fork”). Currently, this is also a major problem in urgent need of food quality and safety in China. In the present study, we will investigate the antimicrobial effect and molecular mechanism of a novel antibacterial agent of 3-coumaroyl-2-hydroxyquinic acid (CHQA) from Cedrus deodara pine needle on foodborne pathogenic bacteria. Especially, we will carry out investigating the inhibitory effects and molecular mechanism of action of CHQA on the biological activity and production of bacterial toxins of Staphylococcus aureus. Firstly, the structure-activity relation (SAR) study will be developed to disclose the effect of the chemical structural characterization of CHQA on antibacterial activity. Next, we will draw to investigate the effects of CHQA on cell membranes and cell metabolic activity and elucidate the mode of action of CHQA on cell functions of Staphylococcus aureus. Finally, we will investigate the effects of CHQA on the productions of Staphylococcal enterotoxin A and -toxins, the expressions of the relative genes and biofilm production, and verify whether CHQA could exhibit antibacterial effect through weakening pathogenic pathway of Staphylococcus aureus. The successful completion of this project will supply experimental data and reference methods, will help develop new strategies for controlling foodborne pathogenic bacteria, and is very valuable for the comprehensive utilizations of C. deodara pine needle.

致病微生物污染引起的食源性疾病是世界上最突出的食品卫生问题，这也是当前我国食品质量安全急需解决的重大问题。本项目拟以雪松松针为切入点，将着重探讨其中新型抗菌剂3-香豆酰-2-羟基奎尼酸（CHQA）对食源性致病菌金黄色葡萄球菌抑制及有害毒素分泌调控的可能分子机制。通过抑菌活性及构效关系的研究，解明CHQA的分子结构特征与抑菌作用的相互关系；分析 CHQA对细胞膜正常生理功能损伤的影响，深入探讨CHQA对细胞代谢活性的影响，阐明CHQA对金黄色葡萄球菌细胞功能的影响及其作用机理；分析CHQA对金黄色葡萄球菌肠毒素A和a-毒素分泌的影响，深入探讨相关调控基因表达的水平，同时研究CHQA对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响，验证CHQA是否通过减弱细菌致病性途径而达到抑菌效果。本项目的顺利完成将为进一步研究雪松松针对食源性致病菌的控制提供实验依据和参考方法，为食源性致病菌抑制剂的研制提供新靶点。

食源性疾病是世界上最突出的食品卫生问题，也是当前我国食品质量安全急需解决的重大问题，本项目研究雪松松针中新型抗菌剂3-香豆酰-2-羟基奎尼酸（CHQA）对食源性致病菌金黄色葡萄球菌S. aureus抑制作用的分子机制。CHQA显示广谱性抑菌作用，特别是对革兰氏阳性菌的抑制效果更好；构效关系研究表明CHQA抑菌作用的关键部位是对香豆酸部分，而对香豆酸与2-羟基奎宁酸的酯化则削弱了其抑菌能力。在细胞水平上分析CHQA对S. aureus细胞膜的影响，结果显示：CHQA破坏S. aureus细胞膜完整性，导致菌体细胞膜超极化，且呈浓度递增影响；导致S. aureus细胞膜流动性增加；CHQA与S. aureus细胞膜蛋白相互作用能改变膜蛋白苯丙氨酸残基的微环境以及能量传递；通过透射电子显微镜观察到CHQA处理S. aureus 细胞壁遭到破坏，发生细胞溶解，细胞内部产生空腔，说明经历了细胞降解、细胞质从细胞内部向周围环境释放的过程。以上结果表明，CHQA通过损伤S. aureu细胞膜正常生理功能而发挥抑菌作用。深入分析CHQA 对S. aureus细胞代谢活性的影响，结果显示：CHQA显著降低S. aureus的胞内ATP浓度，但对胞外ATP浓度无明显影响；CHQA对S. aureus呼吸活性无明显影响，且不能抑制三羧酸循环中的关键酶SDH的活性，故推测CHQA对S. aureus胞内ATP的显著降低是由于ATP水解的增加造成的；CHQA能有效抑制S. aureus DNA合成；CHQA可直接与金黄色葡萄球菌的基因组DNA发生相互作用，且作用方式为沟槽结合。分析CHQA对S. aureus生物被膜形成的影响，结果表明：CHQA在不影响细菌生长的情况下，有效地阻止S. aureus生物膜的形成，导致生物膜细胞代谢活性降低，生物膜结构发生巨大坍塌；CHQA通过影响生物膜的初始附着阶段来抑制生物膜的形成，而对已形成的S. aureus生物膜没有清除作用；CHQA通过氢键和疏水相互作用与S. aureus SrtA的活性区结合，显著抑制其酶活，从而导致细菌的粘附能力降低，进而抑制生物膜的形成；CHQA显著减少附着在不锈钢表面上固着的S. aureus细胞的数量。本研究为食源性致病菌抑制剂的研制提供新靶点，同时为CHQA作为一种潜在的新型天然抑菌剂应用与食品工业奠定理论基础。