EC-SOD基因转染骨髓间充质干细胞延长犬急性脑梗塞“时间窗”的实验研究

Most patients diagnosed with acute ischemic stroke are admitted far behind the "time window" for effecive intravenous thrombolysis. Since intraarterial mechanical thrombolysis is spared from plasminogen activator and ensuing side effects, it contributes to extending "time window" and improving prognosis. However, cerebral reperfusion damage still seems to be inevitable in case of intraarterial mechanical thrombolysis beyond "time window". As reperfusion damage is generally acknowledged as the lipid peroxidation reaction due to overwhelming oxygen free radicals within ischemic region, it is feasible and practical for injected EC-SOD gene transfected MSCs to migrate to ischemic region and secret SOD continously thereby reducing reperfusion damage,accelerating cerebral recovery and improving prognosis. This study is dedicated to exploring the role of MSCs transfected with EC-SOD gene in extended "time window" for beagles with the help of imaging, histology and synchrotron radiation.

急性脑梗塞静脉溶栓因为治疗"时间窗"的限制，大部分病人就诊时已经超出"时间窗"范围，得不到有效的治疗。而动脉内机械性溶栓因不用纤溶酶原激活剂，避免了它所带来的副作用，是最有希望延长治疗的"时间窗"，临床上也取得了不错疗效。但动脉内机械性超"时间窗"溶栓术，仍不能避免血管再通后梗塞部位脑组织的再灌注损伤。缺血再灌注损伤主要是由于缺血区域产生大量的氧自由基引发的脂质过氧化反应。在已通畅的动脉内经微导管直接注入胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)基因转染的骨髓间充质干细胞(MSCs)至梗塞区，操作简单、易行。如果EC-SOD基因转染的MSCs能够在梗塞区存活并不断分泌SOD，不但能够减轻再灌注损伤，而且能促使受损脑组织的恢复，从而提高其治疗效果。本研究以毕格犬脑梗塞模型为研究对象，通过影像学、组织学、同步辐射等先进的实验手段来研究EC-SOD基因转染MSCs延长犬急性脑梗塞"时间窗"的作用机制。

本课题本实验采用经颅立体定位将转染ECSOD的MSCs细胞移植入梗塞区域，术后1d、3d、1w、2w、4w进行行为学评估，我们发现在脑组织局部缺血6h与12h后再灌注1d、3dmNSS评分无显著性差异，考虑术后因麻醉与脑组织本身缺血等多种因素影响导致神经缺损明显且各组间比较无明显差异，术后1w神经功能开始改善，术后4w ECSOD-MSCs组、MSCs组优于PBS组、Model组，ECSOD-MSCs组更优，说明转染ECSOD的MSCs能明显改善大鼠脑梗塞后神经功能缺损。. 本实验在术后1d与28d行MRI检查比较脑梗塞治疗后体积的变化情况，我们可以看出，ECSOD-MSCs组、MSCs组与Model组、PBS组比较梗塞体积缩小的相对值明显多，且ECSOD-MSCs组更多，说明ECSOD能预防缺血后再灌注氧自由基对神经元细胞的再次损伤。从Model组和PBS组可以发现脑组织缺血再灌注后28d的梗塞体积较梗塞后1d体积明显缩小，差异有统计学意义，且6h组梗塞体积缩小的相对值高于12h组，脑梗塞后6h、12h仍存在可逆性恢复的区域，血流恢复后可逆性损伤的脑组织可逐渐恢复；随着时间推移梗死周边的缺血半暗带区域逐渐向不可逆性梗死发展，所以我们越早恢复缺血区域的血流，挽救梗死脑组织越多。. 本实验采用免疫组化观察ECSOD和Bax及Bcl-2在大鼠脑梗塞区域的表达情况，ECSOD-MSCs组与MSCs组比较发现ECSOD在ECSOD-MSCs组表达明显高于MSCs组，bcl-2的阳性细胞率高于MSCs组，且Bax阳性细胞率低于MSCs组有统计学差异，说明ECSOD能预防缺血再灌注对神经元的损害，减少神经细胞凋亡，提高bcl-2的表达，从而改善神经功能预后。. 我们的研究表明利用慢病毒包装的ECSOD基因转染大鼠MSCs可提高SOD表达效率，且转染后不影响大鼠MSCs的生物学特性。移植转染ECSOD的MSCs细胞，脑梗塞区域局部ECSOD表达增加，能减少脑缺血再灌注过程中对神经元的损伤。ECSOD基因与MSCs对缺血脑卒中的治疗具有协同作用，能明显减少缺血后脑梗死的体积。我们初步推测了ECSOD转染MSCs后对缺血性脑卒中的治疗的作用，为临床规范应用提供理论依据。