基于糖代谢工程的化学酶法活细胞表面蛋白探针标记新策略及其初步应用

The bio-orthogonal technologies based on glycoengineering developed in the last few years have brought effective tools for the new insights into glycans. However, current chemoselective bio-orthogonal methods for glycan labeling usually focus on small molecular tags, with few techniques about large bio-molecule probes. Compared with small molecular probes, the large bio-molecules have irreplaceable function. For example, proteins can involve the regulation of cell activities. Therefore, it is urgent to develop a novel strategy for labeling the glycoengineered cells with functional bio-molecules which can be applied to regulate cell activities. This research project aims to develop a novel strategy employing Sortase A-mediated chemoenzymatic ligation to install proteins on the surface of artificial sialic acid engineered cells. At first, the green fluorescent protein (GFP) will be installed on the cell surface by this novel strategy for cell imaging. Additionally, the Fc domain of antibody will be displayed on the surface of tumor cells and further mediate the cytotoxicity of immune system toward tumor cells. This research will not only develop an alternative labeling strategy for current bio-orthogonal technologies, but also provide a preliminary principle and mechanism for cancer immunotherapy.

基于糖代谢工程的生物正交反应，是糖生物学研究的热点。当前研究主要集中于细胞表面糖类分子的小分子探针修饰，无法直接实现生物功能大分子对细胞表面的特异性修饰。因此，迫切需要发展新的策略实现生物大分子对细胞表面的标记，进而研究这些生物大分子在细胞调控中的功能。本项目拟发展基于糖代谢工程的化学酶法新策略，以绿色荧光蛋白GFP为模型，构建活细胞表面蛋白探针特异性标记新方法；并进一步把免疫球蛋白IgG2a的Fc片段修饰到肿瘤细胞表面，进而研究其介导的免疫学功能。本研究是对现有细胞标记方法的补充，同时能为癌症的新型免疫疗法提供理论基础。

基于糖代谢工程的生物正交反应可以对细胞进行标记，为生物学研究提供了有力的工具，而将一些大分子标记到细胞表面则可以进一步地介导生物学功能，如引起免疫杀伤作用等。本项目为了这个目的，发展了基于糖代谢工程和化学酶法的细胞标记新策略并初步应用于肿瘤的免疫治疗中。首先，合成了一系列寡甘氨酸修饰的甘露糖胺衍生物并进行了酶催化的构效关系研究，发现具有较长连接臂的甘露糖胺衍生物能较好地被唾液酸醛缩酶催化。其次，发展了Sortase A酶PEGA树脂固定化以及一锅法原位环化等酶催化策略，并进一步应用于糖代谢工程研究中。第三，通过糖代谢工程和Sortase A酶催化策略将DNP半抗原和ZZ domain蛋白标记于肿瘤细胞表面，并通过体外细胞实验证明这两类修饰都可以招募抗体并介导对肿瘤细胞的免疫杀伤作用。最后，基于以上研究，进一步拓展了招募抗体并靶向肿瘤的免疫杀伤策略，开发了纳米抗体-半抗原偶联物，并通过体外细胞实验、小鼠体内抑瘤实验等，研究了该策略的免疫治疗效果。综上所述，本项目在《资助项目计划书》的基础上开展工作，执行了相关研究，并取得了预期的研究成果，完成了预期的考核指标。