高粱花叶病毒侵染性cDNA克隆的构建及寄主（甘蔗）互作因子的挖掘

Mosaic disease cause significant loss of sugarcane production and reduction of sucrose quality. Sorghum mosaic virus (SrMV) is the major pathogen that was difficult removed by tissue culture. Disease resistance breeding is an effective prevention and control strategy. The conventional identification of sugarcane material for mosaic disease resistance was limited on standardizing the source and quality of virus and the operation of resistance identification. It is difficult to determine the identified result from different departments and different times. This project will construct artificial virus cDNA infectious clone pSrMV, which contains inserting reporter (GFP and ROS1) and flag tag. Basing on the Agrobacterium tumefaciens mediated-transformation (ATMT) of sugarcane, ROS1 reporter could make the symptom of virus infection easy to see, the virus source easy to achieve and the resistance identification easy to standardization, improving the efficiency and the comparability of identification. Basing on GFP reporter, the virus subcellular and tissue location, the virus movement and the biological infection process of virus would be shown. Basing on the flag tag to each virus protein, the host interaction factors could be achieved by co-immunoprecipitation and be identified by RNA-seq and mass spectrometry. Then the interaction network and gene co-expression network between sugarcane and SrMV, and thus the key genes would be identified too. This study would help to understand the molecular mechanisms of sugarcane-SrMV interaction.

花叶病导致甘蔗产量减少和糖分降低，其中高粱花叶病毒（SrMV）是主要病原，且脱毒种苗携带率高，抗病育种是有效的防治策略。抗性鉴定存在毒源及其质量和鉴定操作难以标准化的局限，导致不同单位、不同批次鉴定结果不一致而难以判断。本项目拟采用酵母同源重组等方法，首次构建带ROS1紫色报告基因、GFP荧光报告基因和flag表达标签的重组pSrMV侵染性克隆。利用农杆菌介导侵染甘蔗，基于ROS1裸眼观察SrMV侵染情况，满足毒源不受限和标准化的抗性鉴定需求，提高鉴定效率和可比性；基于GFP观察病毒亚细胞和组织定位及其在寄主细胞和组织内转移，揭示其侵染的生物学过程；基于各个病毒蛋白上融合表达标签，获得与病毒蛋白免疫共沉淀的寄主互作因子集，而后经RNA-seq和蛋白质谱鉴定技术，挖掘寄主互作因子，构建甘蔗和SrMV互作及共表达网络，鉴定获得关键基因，为甘蔗-SrMV互作的分子机制研究奠定基础。

高粱花叶病毒（SrMV）是甘蔗花叶病主要病原之一，当前甘蔗材料的病毒抗性只能通过感病蔗叶的病毒粗提液摩擦接种，接种效率低、客观因素影响大。项目旨在前期克隆获得SrMV基因组片段的基础上构建可方便、高效用于人工接种的病毒cDNA侵染性克隆，具有一定的科学研究是应用意义。主要的研究结果和结论如下：(Ⅰ) 通过甘蔗病毒病原大片段基因组同源重组拼接的方法，获得了高粱花叶病毒SrMV、甘蔗黄叶病毒ScYLV基因组cDNA侵染性克隆，项目最终发现甘蔗病毒侵染性克隆侵染非寄主植物本氏烟时无法实现系统性侵染；而侵染包括寄主在内的禾本科植物时，则存在农杆菌侵染障碍，仍有待继续改善。(Ⅱ) 通过侵染性克隆介导的病毒蛋白瞬时表达，发现在病毒侵染寄主的过程中，侵染性克隆介导的病毒蛋白瞬时表达体现了黄叶病毒蛋白更复杂的亚细胞定位特性，说明病毒蛋白通过与病毒其他蛋白或寄主蛋白形成复合体共同行使功能。(Ⅲ) 通过够高质量酵母双杂交文库，筛选到49个SrMV寄主互作因子，结合前期转录组数据分析发现其中有4个基因在对照和SrMV侵染样品中表现出比较大的表达差异；芯片表达谱数据显示另有4个基因在受SrMV侵染甘蔗抗感品种ROC22、FN15、FN39和YZ01-1413中表现出不同的表达模式，值得后续深入研究。(Ⅳ) 建立了可用于侵染性克隆表达等的甘蔗栽培种原生质体分离及转化体系，通过该体系获得的甘蔗叶鞘原生质体活力和转化效率达均非常高。(Ⅴ) 最后通过RT-PCR克隆了甘蔗Rieske Fe/S 蛋白前体基因ScPetC并对其进行了功能鉴定，分析了其与SrMV蛋白P1、ScYLV蛋白P0的互作，增加了对甘蔗ScPetC功能的了解；同时在转录组数据基础上挖掘分析了甘蔗PIN基因家族，发现部分SsPIN基因家族成员响应高粱花叶病毒侵染。以上研究一方面探究了甘蔗病毒病原的人工改造利用，但仍需进一步研究；另一方面针对响应甘蔗病毒病的寄主基因潜在功能的进行了分析和鉴定，为甘蔗病毒病相关基因的发掘和功能鉴定提供了实验方法参考。项目实施过程培养了3名硕士研究生，发表3篇科研论文。