GnRH和GnIH基因与鹅产蛋性能的关联及分子机制研究

In this study, Sichuan white goose and Xupu goose were used as the experimental materials to explore the GnRH and GnIH genes expression in reproductive gonadal axis at different reproductive stage. In addition, SNPs of GnRH and GnIH genes were screened and genotyping were detected by Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS) methods to investigate the effects of the two genes on goose egg production and reproductive hormone, and to clarify whether the two genes can be used as molecular marker of laying traits or not. Aside from above assay, the roles of the two genes to control viability of granulose cells and reproductive candidate genes expression will be evaluated by addition hormone, RNAi and overexpressed the GnRH and GnIH in primary granulose. These results will provide theoretical basis for further research of molecular mechanism of egg productive performance.

本项目以四川白鹅和溆浦鹅为实验材料，检测GnRH和GnIH基因在不同品种、不同繁殖阶段母鹅生殖性腺轴组织中的时空表达规律，进而利用高通量的飞行时间质谱技术对GnRH和GnIH基因进行SNP扫描和个体基因型分析，阐明基因表达规律及序列变异与母鹅产蛋量和血液生殖激素含量之间的关联，确定其能否作为分子标记应用于鹅育种实践中；同时以鹅原代卵巢颗粒细胞为实验材料，通过外源添加激素、过表达和RNAi等手段研究GnRH和GnIH基因对卵巢颗粒细胞活性的影响，及其对其他繁殖性状候选基因的表达调控作用，探讨这两个基因可能的生物学功能，为进一步研究调控鹅产蛋性能的分子机制奠定理论基础。

鹅繁殖力低下制约了鹅产业的发展，确定影响鹅繁殖的关键激素和基因是有效的展开高产新品种鹅分子育种的关键。促性腺激素释放激素(GnRH) 和促性腺激素抑制激素（GnIH）共同参与调控动物的繁殖性能，在生殖过程中发挥重要作用。.本课题以四川白鹅（高产）和溆浦鹅（低产）为实验材料，利用放射免疫法和酶联免疫法完成测定8种生殖激素（GnRH、GnIH、FSH、E2、PRL、LH、T和VIP）。结果表明GnRH、GnIH、FSH和LH激素在不同繁殖阶段、不同品种间有极其显著的变化，而且PRL和E2显著影响鹅抱性，进而影响鹅繁殖性状；完成人工光照组和自然光照组血液生殖激素的测定。研究发现光照通过血液FSH、LH、E2和PRL激素浓度进而调控鹅繁殖性能。.利用本课题组构建的鹅基因组序列，克隆鹅GnRH基因3520bp DNA序列，包含完整的4个外显子和3个内含子区域，279bp CDS编码92个氨基酸的前体蛋白。克隆鹅GnIH基因3603bp，包含完整的3个外显子和2个内含子区域，519bp cDNA序列编码172个氨基酸的前体蛋白。完成了GnRH和GnIH基因mRNA中下丘脑、垂体、卵巢、心脏、肝脏、脾脏等16组织中的表达情况，研究发现产蛋前期和产蛋高峰期的下丘脑和卵巢组织中，四川白鹅的GnRH mRNA表达量显著(p < 0.05)或极显著(p < 0.01)高于溆浦鹅，在产蛋高峰期和休产期四川白鹅GnRH激素浓度也极显著(p < 0.01)或显著高于(p < 0.05)溆浦鹅，这提示鹅GnRH基因和激素在繁殖过程中发挥重要的作用。.GnRH和GnIH基因中分布检测出56个和28个SNP位点，利用线性模型与产蛋性状和体组成性状进行相关性分析，发现GnRH基因与鹅产蛋性状有显著或极显著的关联，GnRH和GnIH基因的SNP位点与体组成性状显著或极显著相关；.完成以卵巢颗粒细胞为实验材料研究GnRH和GnRH基因功能，添加GnRH激素激动剂或抑制剂、转染GnRH和GnRH的干扰载体、过表达载体。利用试剂盒检测颗粒细胞的增殖凋亡，并利用高通量方法检测处理后颗粒细胞中基因表达水平，并通过Real-time PCR和Western blot方法验证筛选出的繁殖性状候选基因，研究表明GnRH可能通过与细胞连接有关的自分泌或旁分泌途径。