粘细菌新型麦芽糖淀粉酶AmyZ产高纯度麦芽糖的催化机制研究

Amylolytic enzymes are important industrial enzymes which are widely applied in food, animal nutrition and medical industry, exploring excellent amylolytic enzymes becoming more and more popular and significant. In our previous research we cloned a new maltose-producing α-amylase from myxobacterium Corallococcus sp. EGB, about 90% level of maltose was produced without glucose during the hydrolysis reactions. High-efficiency catalytic reactions were achieved with the 2 mM and 200 mM maltotriose, which indicated that novel catalytic mechanism may exist, which is different from the reported amylases. In this research, the catalytic mechanism that involved in the production of high purity maltose is studied, the process of the molecular catalysis will be clarified by product analysis and methylation modification and 14C radioisotope labeling. The key functional amino acids also be researched based on sequence analysis and crystal structure analysis. The catalytic mechanism that involved in the production of high purity maltose will be clarified from the research. Our research will provide theory evidence for the application of AmyZ in the future.

麦芽糖淀粉酶是一种重要的工业用酶，在食品、饲料、酿酒和医药工业等领域具有广泛的应用，发掘性能优良催化机制明确的麦芽糖淀粉酶具有十分重要的意义。本课题组前期获得一种来源于粘细菌的具有较高催化效率的新型麦芽糖淀粉酶，其淀粉水解产物中麦芽糖含量高达90%且不含葡萄糖。在以低浓度（2 mM）和高浓度（200 mM）麦芽三糖为底物时，该酶均能够高效产生麦芽糖且终产物中无葡萄糖产生，表明该淀粉酶水解过程中可能存在一种与已报道淀粉酶不同的催化机制。本项目拟对该麦芽糖淀粉酶产高纯度麦芽糖的催化机制进行研究，利用高效液相色谱、甲基化修饰以及14C放射性同位素标记技术分析酶解产物，阐明该麦芽糖淀粉酶产麦芽糖过程中底物识别和多分子催化反应过程。通过序列分析和酶晶体结构解析，确定参与催化反应的关键氨基酸的催化功能。本研究将阐明麦芽糖淀粉酶产高纯度麦芽糖的催化机制，以期为麦芽糖淀粉酶的后续应用奠定基础。

麦芽糖淀粉酶是一种重要的工业用酶，在食品、饲料、酿酒和医药工业等领域具有广泛的应用，发掘性能优良催化机制明确的麦芽糖淀粉酶具有十分重要的意义。本项目基于前期基础中获得一种来源于粘细菌的具有较高催化效率的新型麦芽糖淀粉酶，开展该淀粉酶产高纯度麦芽糖的多分子催化机制研究。所获得的主要成果为：（1）以枯草芽孢杆菌为宿主，建立了麦芽糖淀粉酶的高效表达系统，表达量为112mg/L，同时以大肠杆菌为宿主，建立了密码子优化和蛋白复性获得活性蛋白的方法；（2）麦芽糖淀粉酶通过水解和转糖基作用，破坏淀粉颗粒完整结构，淀粉外侧链变短，麦芽糖积累，显著抑制淀粉老化；（3）发现麦芽糖淀粉酶具有生淀粉水解活性，比活力为1.14U/mg；（4）将麦芽糖淀粉酶归类于糖苷水解酶一个新的亚家族-GH13_36，该酶建立了多分子催化反应模型，即以内切型的水解方式随机释放一系列麦芽寡糖，催化过程中，酶与产生的葡萄糖基团形成复合物，通过转糖基作用将葡萄糖供体转移至G1,G2以及潘糖等受体上，形成一系列的低聚糖，聚合度高达20左右，随后通过水解作用产生高纯度麦芽糖G2，在此过程中，转糖基和水解反应同步进行；（5）CoMA 的多分子催化活性都由同一活性中心的氨基酸残基(D243-E286-D359)发挥作用，包括水解作用和转糖基作用，此外，发现F314对于酶的活性至关重要；（5）基于催化机制解析，通过淀粉转化实验，发现麦芽糖得率高达 58%(w/w)。