褪黑素对成骨细胞作用的浓度依赖性机制研究

The melatonin secreted mainly by pineal body, has been shown to be responsible for the occurrence and development of idiopathic scoliosis, IS. Whether the supplements of melatonin can prevent the development of IS is still controversial. For this, we studied the influence of melatonin on osteoblast in the preliminary research to clarify the treatment uncertainties of melatonin. Our experiments revealed that melatonin has dual effects on osteoblast proliferation, depending on its concentration,that is, promoting in low concentration and inhibiting in high concentration. This to some extent explains the reason why the supplements of melatonin cannot prevent deformity progress may possibly due to improper melatonin concentration, but its mechanism is still unknown. Our previous and other scholars researches also showed that with the increase of the melatonin concentration, receptor dependence approach opens, inhibits and finally activates voltage dependence approach. Thus, we presume the concentration-dependent effects of melatonin is relevant with G-protein coupled receptors mediated calcium pathways and L voltage dependent calcium channel. Basing on our previous studies and applying molecular biology, electrophysiology technology and RNA interference technology, we will further reveal the role of concentration-dependent melatonin in osteoblast proliferation in vivo and in vitro, thus providing new molecular targeted therapy for IS.

褪黑素是一种主要由松果体合成的激素，与特发性脊柱侧凸（IS）的发生和发展密切相关。但补充褪黑素能否能阻止IS发展，尚存在争议。为此我们在前期拟通过研究褪黑素对成骨细胞的影响以阐明褪黑素治疗效果的不确定性。研究发现，褪黑素对成骨细胞增值具有双重效应，低浓度促进,高浓度抑制，并存在浓度依赖性,在一定程度上说明补充褪黑素没有阻止所有畸形进展的原因很可能是由于褪黑素应用的浓度不适造成，但其作用机制不明。我们前期及其他学者的研究也表明，随着褪黑素浓度的增加，受体依赖性途径从开启到抑制，最后启动电压门控依赖性途径。由此推测褪黑素对成骨细胞作用的浓度依赖机制与G蛋白介导的钙通路和L型电压依赖性钙通道相关。本项目拟在我们前期研究基础上，从在体和离体两方面，运用分子生物学、电生理学、RNA干预等技术手段，研究褪黑素对成骨细胞作用浓度依赖的作用机制，为IS分子水平治疗提供新途径。

褪黑素是一种主要由松果体合成的激素，与骨科疾病如特发性脊柱侧凸（IS），骨质疏松症和骨肉瘤的发生和发展密切相关。但褪黑素能否治疗上述疾病，尚存在争议。为此我们在前期拟通过研究褪黑素对成骨细胞的影响以阐明褪黑素治疗效果的不确定性。研究发现，褪黑素对成骨细胞增值具有双重效应，低浓度促进；高浓度抑制，并存在浓度依赖性,在一定程度上说明褪黑素治疗骨科相关疾病存在争议是由于褪黑素应用的浓度不适造成，但其作用机制不明。本课题实在前期研究的基础上，采用细胞水平→动物水平逐级论证的方法，进一步在成骨细胞，成骨肉瘤样细胞上，全面深入探讨褪黑素对成骨细胞的浓度依赖的作用机制，检测褪黑素浓度依赖性的作用机制与G蛋白偶联型受体介导信号转导通路的相关性，再运用慢病毒RNA干预技术沉默褪黑素受体和增殖相关蛋白的表达，进一步明确褪黑素浓度依赖性调控成骨细胞增殖的作用机制。建立双足鼠对侧拴系脊柱侧凸模型，在动物水平验证褪黑素调控成骨细胞的机制与G蛋白偶联型受体介导的信号转导通路相关。经过实验发现：低浓度褪黑素（1nm-100nm）作用于褪黑素受体和G蛋白偶联受体，同时激活PKA和钙通道，引起CRE依赖性转录活性的改变，进而上调CREB磷酸化的表达，褪黑素通过调节CREB的转录活性结合RFC3启动子，激活RFC3的表达，激活RFC3引起PCNA被加载到染色质通过五聚夹子装载在RFC复合物上，促进细胞增殖；随着褪黑素浓度的增加（1-2mM），G蛋白介导的通路由促进转为抑制，激活L型电压依赖性钙通道，钙超载，引起内质网应激标志性蛋白 GRP78 和 CHOP的表达增加，成骨细胞内质网应激诱导自噬标志性蛋白LC3-II的积累，引起成骨细胞自噬，抑制成骨细胞增殖；更高浓度（4mM）时，下调细胞周期G 1期相关蛋白cyclinD1和CDK4的表达，细胞周期G 2期相关蛋白cyclinB1和CDK1的表达，抑制成骨肉瘤样细胞的增殖，为特发性脊柱侧凸、骨质疏松症和骨肉瘤的分子水平治疗提供新途径。