DNA甲基化对植物响应重金属胁迫的调控作用

Heavy metals in soil are deleterious to human health, which enter human body by food chain. This harmful issue can be avoided by properly regulating the response of plants or crops to heavy metals stresses by molecular biotechnologies. Our previous result of methylation sensitive amplified polymorphism (MSAP) proved stress of Lead (Pb) or Cadmium (Cd) alters the DNA methylation status in Nicotiana benthamiana genome. 14 genes involved in plant development and growth were isolated in this experiment. But the regulation of DNA methylation status to these genes’ expression patterns and the roles of these genes playing in response to heavy metal stresses are undergoing further detecting. Based on these data, further experiments will be set to explore how DNA methylation regulates genes expression patterns and what the functions of these genes play when exposed to Pb or Cd stress. Virus induced gene silencing (VIGS), methylation-specific PCR (MS-PCR) and real-time PCR will be used in the above researches. The objective of this application is to identify genes which play indispensable roles for plants in response to heavy metal stresses and eventually to shed light on the mechanisms how DNA methylation regulate these genes expression in such process. This application will ultimately benefit genetic modification on the absorption and accumulation of heavy metals in plants.

土壤重金属污染会引起农作物减产，还可进入食物链毒害人和动物健康。改变植物吸收和积累重金属的能力，可解决这个问题。加强植物响应重金属胁迫机理的研究，可揭示植物吸收和代谢重金属的分子机制。申请者利用甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）研究重金属胁迫对植物基因组DNA甲基化水平的影响，发现很多基因参与了植物应答重金属胁迫过程。但是目前不清楚DNA甲基化如何调控这些基因的表达，也不确定这些基因在植物响应重金属胁迫过程中的功能。本申请拟通过甲基化特异性PCR （MS-PCR），病毒诱导的基因沉默（VIGS）和real-time PCR等技术，分析这些基因的DNA甲基化水平与重金属胁迫的关系，初步揭示这些基因在植物响应重金属胁迫过程中的功能。通过本项研究，申请者希望找到几个控制植物响应重金属胁迫的基因，探索DNA甲基化对植物响应重金属胁迫的调控作用，为定向改良植物代谢重金属能力提供理论支持。

土壤重金属污染会引起农作物减产，还可通过食物链毒害人和动物健康。改变植物吸收和积累重金属的能力，可解决这个问题。加强植物响应重金属胁迫机理的研究，可揭示植物吸收和代谢重金属的分子机制。.本项目利用甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）研究重金属胁迫对植物基因组DNA甲基化水平的影响，克隆了14条响应镉、铅胁迫基因。我们通过甲基化特异性PCR （MS-PCR），病毒诱导的基因沉默（VIGS）和real-time PCR等技术，分析这些基因的DNA甲基化水平与重金属胁迫的关系，初步揭示这些基因在植物响应重金属胁迫过程中的功能。通过geNorm和NormFinder程序对ACT、TUB、18SrRNA、PP2A、GAPDH和EF1a 6个候选内参基因进行筛选，最终选择EF1a作为不同浓度Cd处理下qRT-PCR的最优内参基因。通过qRT-PCR技术，研究响应Cd或Pb胁迫候选基因的表达情况，结果表明候选基因在不同浓度重金属离子处理下的表达水平有差异。13条候选基因是首次被发现DNA甲基化发生区域在基因区（gene body），而非启动子区。目前学术界对于基因区DNA甲基化的功能研究结论并不一致，这类修饰对于特定基因在响应特定生物或非生物胁迫反应中的功能和生物学意义尚不清楚。不同浓度Cd2+或Pb2+处理本氏烟草，能够引起候选基因外显子或内含子区域DNA甲基化水平发生变化。分离克隆了NbMORC3和NbWRKY22基因属于转录因子类，对于理解植物响应重金属胁迫过程中的信号转导、基因表达调控等分子机制，提供了新的目标基因。亚细胞定位结果显示：NbDDRP定位在叶绿体、细胞质和细胞核中；NbMORC3、NbEF、NbNADH、NbWRKY22定位于细胞核。NbVAPF没有观察到荧光信号，推测其可能定位于液泡，液泡中pH偏低，影响GFP发光。.通过本项研究，我们找到几个控制植物响应重金属胁迫的基因，并探索了DNA甲基化对植物响应重金属胁迫的调控作用，为后续定向改良植物代谢重金属能力提供理论支持。