核衣壳靶向病毒灭活策略筛选高效抗猪2型圆环病毒基因

猪2型圆环病毒（PCV2）是猪断奶后多系统衰竭综合征的原发性病原，并与猪皮炎肾病综合征、仔猪先天性震颤、猪繁殖障碍综合征等多种疫病相关，统称为PCV2病，是造成当今世界养猪业重大经济损失的主要病原之一，但目前缺乏有效防治药物。通过转基因技术培育抗病品种是降低PCV2病对养猪业造成损失的有效途径之一。而抗病基因筛选是转基因抗病品种培育的前提。核衣壳靶向灭活策略（CTVI）是一种新的抗病毒策略，与基于核酸的siRNA、核酶等策略相比优势显著，能有效避免因病毒变异引起的免疫逃逸等问题。本课题组在前期工作中对该策略在抗PCV2中的适用性进行了初步研究，获得了具有一定抗病毒能力的抗病基因，本项目拟在此前期工作基础上，对已获得的抗病基因进行重新设计，通过细胞水平和转基因小鼠模型分析，进一步筛选获得更为高效的抗病毒基因。为抗PCV2转基因猪品种的培育奠定基础，也进一步拓宽CTVI策略的适用范围。

本研究通过对前期工作进行分析研究、基因改造、表达载体构建、转基因细胞系和转基因小鼠研究，同时还开展了RNA聚合酶II驱动的长双链干扰RNA的研究，通过这些研究：（1）我们首次发现了外显子序列对内含子的功能具有潜在的影响，这为转基因动物研究中相同载体不同外源基因表达水平差别非常明显找到了一个可能的原因，这也为转基因动物外源基因表达水平的分析提供了新的线索。；（2）通过基因设计和改造和转基因细胞系分析获得了一个在细胞水平上抗病毒效果明显改善的基因结构；（3）通过转基因小鼠分析重新设计和改造的基因在活体中具有良好的抗猪Ⅱ圆环病毒的能力，在病毒血症发生期，可使血液中的病毒滴度与对照相比下降50%-87.5%，多数下降75%。这为抗猪Ⅱ圆环病毒转基因猪的制备奠定了重要基础，同时首次证实CTVI策略不仅只适用于有包膜的病毒，对非包膜病毒同样有效。(4) 以鸡卵清蛋白基因3’侧翼序列中保守序列为模型尝试建立了单链半二聚体锌指核酸酶组装技术，为定点整合转基因动物的研究奠定了重要基础。（5）同时初步开展的RNA聚合酶Ⅱ识别启动子驱动的长双链干扰RNA的研究为时空特异性表达抗病毒干扰RNA的研究奠定了一定的基础，为进一步开展抗病毒基因的筛选建立了一个良好的开端。