影响H5N6亚型禽流感病毒宿主倾向性的关键氨基酸位点的挖掘及分子机制研究

The constant outbreaks of HPAIV H5N6 are reported in China and South Asia, and continually lead the affected to death, hence the research is of great threaten in poultry industry and public health. According to the previous research, it is found that the pathogenesis of H5N6 JXD and XGD to mice presents one strong and another weak. And more importantly, the genetic background of JXD is extremely similar to XGD, and the only thirteen amino acids are different, which located in PB1, PA, HA, NA, NS1. It remains unclear that the differences of amino acids of H5N6 exert an influence on infecting mice and its pathogenicity. Based on this, this research will define the critical gene of high pathogenicity of H5N6 to mice through reverse genetics technology; identify the key amino acids on the critical gene; and analyze the effective and specific molecular strategies. The research results will provide direct theoretical basis for flu outbreak warning, further broaden and enhance people’s cognitive level of influenza virus and offer scientific evidence for developing new-typed influenza vaccination and anti-influenza virus drug.

H5N6亚型禽流感病毒在我国及东南亚国家家禽中持续流行，并出现人感染和死亡病例，对养禽业和人类健康构成巨大威胁。通过前期研究我们发现两株H5N6病毒（分别命名为JXD和XGD）对小鼠的致病性呈现典型一强一弱。更为重要的是，二者遗传背景极为相似，仅在PB1、PA、NP、NS1、HA和NA蛋白上存在13个氨基酸的差异。这些差异的氨基酸在H5N6病毒感染小鼠和致病性中的作用及机制尚不清楚。本研究以此为切入点，通过片段置换明确H5N6感染小鼠呈现高致病性的关键基因；进一步鉴定出位于关键基因片段上的关键氨基酸位点；最后解析其发挥效应的具体分子策略，预期研究结果将为流感疫情预警提供直接的理论依据，进一步拓宽和提高人们对流感病毒致病机制的认知水平，为研制新型流感疫苗和抗流感病毒药物提供必要的科学依据。

H5N6亚型禽流感病毒在我国及东南亚国家家禽中持续流行，并出现人感染和死亡病例，对养禽业和人类健康构成巨大威胁。通过前期研究我们发现两株H5N6病毒（分别命名为JXD和XGD）对小鼠的致病性呈现典型一强一弱。更为重要的是，二者遗传背景极为相似，仅在PB1、PA、NP、NS1、HA和NA蛋白上存在13个氨基酸的差异。这些差异的氨基酸在H5N6病毒感染小鼠和致病性中的作用及机制尚不清楚。本研究以此为切入点，首先通过受体结合实验发现XGD，JX H5N6亚型禽流感病毒均与禽样受体和人样受体结合，但以禽样受体为主。在体外的增殖实验表明，XGD、JX毒株分别在CEF、MDCK和A549细胞上的增殖能力相当。动物实验表明，与XGD毒株相比，JX毒株在小鼠上致病力更强。通过片段置换明确H5N6感染小鼠呈现高致病性的关键基因；通过感染性克隆发现JX强毒株NS片段替换为XGD的NS片段，小鼠致病力减弱。进一步通过点突变证实，JX强毒株NS1 第206位氨基酸由G突变成R,小鼠致病力变弱。随后我们通过对两株病毒感染小鼠的脑进行转录组分析，脑转录组共检测32716 个基因, 与空白对照相比，脑感染H5N6病毒后，240基因显著发生变化。其中 179 显著上调，61个基因显著下调。差异显著变化基因聚焦在Herpes simplex infection, Glutamatergic synapse, Chemokine signaling pathway 等通路。进一步发现小鼠脑部感染H5N6流感病毒下调PGRMC1的表达，在SK-N-SH和U251细胞上得到验证。PGRMC1抑制剂AG205可以促进H5N6流感病毒在细胞上的增殖,并且缺失PGRMC1也可以促进流感病毒在细胞上的增殖。PGRMC1抑制剂AG205可以抑制病毒（AIV，Sev），poly(I:C)等诱导U251产生干扰素的水平。AG205可以抑制RIG-I诱导的干扰素水平，而对其他下游分子无明显抑制作用，过表达PGRMC1可以促进RIG-I诱导的干扰素水平。H5N6流感病毒在神经胶质细胞中通过下调PGRMC1表达，抑制RIG-I 诱导的干扰素水平，从而利于病毒本身的复制。我们的研究结果进一步拓宽和提高人们对流感病毒致病机制的认知水平，为研制新型流感疫苗和抗流感病毒药物提供必要的科学依据。