朊病毒突变体D178N-129M/V导致不同表型神经疾病的生物化学基础

朊病毒（Prion）又称蛋白质侵染颗粒，是只含有蛋白质而不含有核酸的新型亚病毒。人 PRNP基因D178N突变与M129连锁，引起致死性家族性失眠症（FFI）；D178N突变与V129连锁，则引起克雅病（CJD）。.在报道中国首例FFI家系并发现细胞型朊蛋白与小分子热休克蛋白alphaB-crystallin相互作用（FEBS Lett.2005;J Neurol.2007）的基础上，本项目利用分子筛液相色谱、质谱、免疫共沉淀等技术，比较研究朊病毒突变体D178N/M129、D178N/V129(23-231aa)在二级结构、聚集途径、抗蛋白酶消化、与分子伴侣alphaB-crystallin和神经递质受体NMDAR结合能力等方面的差异及其与氧化应激、细胞凋亡的关系。揭示D178N-129M/V导致不同表型神经疾病的生物化学基础，为阐明神经退变性疾病的致病机制并控制其发生、发展奠定基础。

朊病毒（Prion）又称蛋白质侵染颗粒，是只含有蛋白质而不含有核酸的新型亚病毒。人PRNP 基因D178N 突变与M129 连锁，引起致死性家族性失眠症（FFI）；而D178N 突变与V129 连锁，则引起克雅病（CJD）。本项目利用分子筛液相色谱、质谱、圆二色光谱及免疫共沉淀等技术，比较研究朊病毒突变体D178N/M129、D178N/V129（23-231aa）在二级结构、聚集途径、抗蛋白酶消化、与分子伴侣结合等方面的差异及其与氧化应激、细胞凋亡的关系。. 研究结果表明，朊蛋白突变体D178N/M129相对于野生型朊蛋白的热力学稳定性显著降低，M129V的连锁突变一定程度上提高了其热力学稳定性。以高效液相色谱结合质谱技术检测体外氧化损伤表明，D178N/M129相较于野生型朊蛋白或突变体D178N/V129更易被氧化损伤。圆二色光谱分析表明氧化修饰产物具有相对更多的β-折叠含量且热力学稳定性进一步降低。D178N的氧化修饰一定程度上增强了其抗蛋白酶K消化的能力。以ThT外源荧光光谱检测D178N/M129的错误折叠动力学，实验结果表明朊蛋白突变体D178N/M129形成纤维化聚集所需的时间相对于D178N/V129更短。此外，在发生氧化损伤后D178N/M129纤维化聚集的延滞期增加，而D178N/V129最终的ThT荧光值显著降低。以上结果反映出朊病毒蛋白的两种病理性突变体在氧化与非氧化状态下的错误折叠具有各自不同的特点。在体外生化实验的基础上，以共聚焦荧光显微镜考察了细胞中朊蛋白及其突变体的聚集状态及细胞定位，结果表明正常朊蛋白主要定位于细胞膜上，而朊蛋白突变体D178N/M129在更易沉积于细胞内质网。此外，还发现在低pH条件下，细胞大分子拥挤环境能够诱导朊蛋白形成具有神经毒性的富含β-折叠的寡聚体形式。而驻留在内质网的分子伴侣Calnexin能与朊蛋白特异性结合并有效地抑制朊病毒蛋白的聚集及由之产生的细胞毒性。. 上述研究揭示了 D178N-129M/V 导致不同表型神经疾病的生物化学基础，为阐明神经退变性疾病的致病机制并控制其发生、发展提供了理论依据。在FASEB J（2010）、J Cell Biochem.（2010）以及Autophagy（2011）等主流学术期刊发表系列研究论文。