海洋小单孢源pyrazolofluostatins中的吡唑环生物合成机制研究

Pyrazolofluostatins, as novel nature products with unique pyrazolo group, were isolated from marine derived Micromonospora. rosaria SCSIO N160 and exhibited moderate antioxidation and antimicrobial activities. Although pyrazolo group play an important role for the diverse pharmaceutical activities of nature products, rare reports appeared about the pyrazolo ring biosynthesis up to now. In previous study, we had cloned and identified fluostatins biosynthesis gene cluster as well as constructed the genetic manipulation system of M. rosaria SCSIO N160. On the basis, this project aims to carry out the following research around pyrazolo ring biosynthesis of pyrazolofluostatins: (1) Locating the biosynthetical genes for pyrazolo ring formation of pyrazolofluostatins and ascertaining the origin of nitrogen by feeding the mutant strain with 15N labeled precursors; (2) Identifying the function of post tailoring enzymes for pyrazolo ring formation and interpreting the mechanism for pyrazolo assembly; (3) Based on the above research, applying combinatorial biosynthesis technology to get more pyrazolofluostatins analogues with better pharmaceutical activities.

Pyrazolofluostatins是从海洋小单孢菌Micromonospora rosaria SCSIO N160中分离鉴定的包含独特吡唑环结构的新天然产物，具有一定的抑菌活性及抗氧化活性。吡唑环是天然产物发挥多种药理活性的重要官能团，但其生物合成机制鲜有报道。前期研究中，本课题组克隆鉴定了fluostatins生物合成基因簇并建立了SCSIO N160的遗传操作体系。在此基础上，本项目拟围绕pyrazolofluostatins吡唑环生物合成机制开展以下研究：（1）定位pyrazolofluostatins吡唑环生物合成基因，通过15N标记前体喂养pyrazolofluostatins高产突变株确定吡唑环N原子来源；（2）鉴定吡唑环形成的后修饰酶的功能，阐释吡唑环形成机制；（3）在上述基础上开展组合生物合成研究，以期获得更多具更好药理活性的pyrazolofluostatins。

Fluostatins是从海洋来源蔷薇小单孢菌Micromonospora rosaria SCSIO N160中分离鉴定的非典型角环素类化合物，具有一定的抑菌活性及抗氧化活性，其中的pyrazolofluostatins包含独特的吡唑环结构，是发挥多种药理活性的重要官能团，但其生物合成鲜有报道。本项目围绕fluostatins生物合成开展了以下研究：（1）定位pyrazolofluostatins吡唑环生物合成基因，通过15N标记前体喂养pyrazolofluostatins高产突变株确定吡唑环N原子来源；（2）鉴定fluostatins生物合成途径后修饰酶的功能；（3）对从功能基因缺失突变株及异源表达菌株分离鉴定的新化合物进行生物药理活性评价。.主要取得了以下研究成果：（1）通过生物信息学分析定位了fluostatins生物合成途径中与吡唑环合成有关基因，构建了8个与吡唑环合成有关基因的缺失突变株，从关键基因缺失突变株及异源表达菌株共分离鉴定新化合物11个，部分化合物具有细胞毒活性，抗革兰氏阳性致病菌活性及a-葡萄糖苷酶抑制活性。（2）通过基因敲除及产物分离鉴定，初步确定flsN3可能与pyrazolofluostatins末端线性氮原子合成有关；通过15N标记的前体喂养实验，确定吡唑环上的一个氮原子来自于谷氨酸。（3）通过体外酶反应阐明了黄素氧化酶FlsO1催化C-5位羟化的功能以及水解酶Alp1U催化fluostatin C环氧开环功能。.本项目为包含N-N键化合物的生物合成提供了理论基础，拓展了非典型角环素的结构多样性，为药物先导化合物的筛选提供分子支撑，对非典型角环素后修饰酶的功能研究为基于构效关系的活性化合物的结构改造提供了酶学元件。