PBU诱导尾巨桉体胚发生的受体基因分离及与miR166应答机制研究

Eucalyptus is the main no-timber trees in tropical and subtropical regions. Eucalyptus is the most important forest tree in China, covering more than 3.68 million hectares of commercial plantations. More than 50% pulp is provided by Eucalyptus. Embryonic callus and somatic embryogenesis induction has always been given great concern as a superior acceptor system of gene transfer. Embryonic callus and somatic embryogenesis in Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis was induced by PBU(patent number: ZL200510035860.X), which is a surface-active new plant growth regulator on plant tissue culture of flower plants and nursery stock in South China. Our research found that the miR166 family expression level increased significantly in the process of Eucalyptus somatic embryogenesis, and showed a close correlation with PBU. In this study, We will study the response mechanism of the upstream hormone response element of miR166 gene to PBU by separating the PBU receptor and its target gene, and find out the biological function of PBU and miR166 gene in the process of somatic embryos occurred in Eucalyptus urophylla× Eucalyptus grandis. With this work, we lay the foundation for the molecular mechanism of somatic embryogenesis of Eucalyptus and to further promote the application of PBU in Eucalyptus micropropagation and somatic embryogenesis.

桉树是世界三大经济林树种之一，中国桉树种植面积已有368万hm2，占国内纸浆用材的50%以上。作为遗传转化的良好受体，胚性愈伤组织及胚状体的诱导一直深受研究者重视。近年来，应用本实验室自主合成且在南方花卉苗木组织培养中广泛应用的新型植物生长调节剂PBU（专利号：ZL200510035860.X）调控尾巨桉愈伤组织分化，获得了高频发生的胚性愈伤组织和体细胞胚。前期研究中发现，miR166 家族在桉树体胚发生过程中，表达水平上调显著，且与PBU的诱导作用表现出较紧密的相关关系。本研究通过分离PBU受体及其目标基因，探讨miR166基因上游激素响应元件与PBU的应答机制，确定PBU及miR166基因在尾巨桉体胚发生过程中的生物学功能，为解析桉树体胚发生的分子机理提供依据，进一步促进PBU在桉树离体快繁及体胚发生中的应用。

桉树是世界三大经济林树种之一，中国桉树种植面积已有370万公顷，占国内纸浆用材的50%以上。作为遗传转化的良好受体，胚性愈伤组织及胚状体的诱导一直深受研究者重视。随着近年在本地区相继投产几个70万吨以上规模的纸浆厂与原料林基地的建设，华南地区对优质纸浆用材新桉树品种需求很大。本研究小组对照本项目研究工作计划，已完成预定研究内容，达到预期研究目标。通过本项目的实施，建立了尾巨桉体细胞胚高效发生的再生体系，体胚发生率达到30%以上，建立了一种带有可视化筛选标记的尾巨桉基因高效编辑的CRISPR/Cas9系统，提高阳性转化后代的筛选效率，进而有效提高了基因编辑的效率；克隆获得尾巨桉PBU受体的全长cDNA，与已知序列相似率达到98%，利用本课题组自主开发的CRISPR/Cas9技术及回复突变方法，通过正向与反向遗传学方式研究了HD-ZIP III与miR166在尾巨桉体细胞胚中的生物学功能，探明了在胚状体发生过程中ARR14表达差异，并结合高通量生物测序分析结果，初步鉴定了miR166基因上游激素响应元件与PBU的响应机制。.在本项目资助下，项目组公开发表标注的相关论文10篇，其中SCI收录论文两篇，中文核心7篇，学术会议论文集收录2篇。获国家授权专利3项，新申请相关专利6项。项目负责人参加19届国际植物学会学术年会1次；全国遗传学大会、全国植物学大会以及全国桉树学术年会各1次；参加广东省植物学会、植物生理学会年会各1次。项目负责人获国家留学基金委公派到美国加州大学圣地分校访学交流、获批广东省“扬帆计划”高层次人才项目1项、晋升副教授职称，新担任广东省植物生理学会理事。项目组成员参加全国及省级学术会议多次。新增副高3人，获博士学位1人，培养青年教2名，培养硕士研究生2人，培养本科学生多名。指导参与项目研究的本科学生获全国大学生生命科学竞赛全国二等奖、三等奖及优秀奖各1次，研究成果获广东省植物生理学会、广东省植物学会年会优秀学术报告二等奖及三等奖各1次。.