龙眼体胚发生过程中miRNA的分离与鉴定

miRNA在植物体胚中具有重要调控作用，但植物体胚miRNA尚未见系统研究。本研究利用龙眼体胚发生系统，主要采用直接克隆法（小RNA文库法）和生物信息学法（自建EST文库）分离龙眼体胚发生过程中的miRNA，并利用生物信息学法预测和筛选龙眼体胚候选miRNA；采用PAGE/Northern Blot对候选miRNA进行实验验证；对候选miRNA进行靶基因预测及功能分析，克隆部分候选的靶基因；利用qPCR 技术对预测和分离得到的部分候选miRNA和靶基因在转录水平上进行验证和表达谱分析；分析龙眼miRNA 及其调控的靶基因在体胚发生过程中所起的作用。该研究旨在比较系统地了解龙眼体胚发生过程miRNA的种类和表达谱，明确参与龙眼体胚发生过程中密切相关的关键miRNA及靶基因，更深入揭示miRNA在体胚中调控作用，为揭示植物体胚发生的分子机制提供新的线索，并为调控龙眼等果树胚胎发育提供理论依据。

经过3年的努力，本项目按计划完成了研究任务，并超额完成部分任务指标。首先，参照实验室已建立的方法，获得龙眼体胚各阶段同步化材料。建立了龙眼体胚miRNA分离技术体系。提取总RNA，用于转录组测序，获得大量的EST，用于进一步的miRNA前体和初级体的分离以及靶基因的分离；同时，提取总RNA，再分离、富集小RNA，用于solexa测序。采用高通量测序方法，进行龙眼胚性愈伤组织转录组测序，共获得6万多个unigenes。KEGG代谢网络分析表明，龙眼EC牵涉到119个代谢途径。 深度个性化分析发现，龙眼胚性愈伤组织不但表达的基因数量巨大，而且表达了大量包括开花、授粉受精等与生殖生长等相关的基因，提出了胚性愈伤组织可能是体胚分子水平上的“缩影”的新观点。小RNA文库Solexa测序表明：共得到6,553,782条Unique 序列，其中仅13,151条序列与已知的miRNAs 相似；sRNA 以24 nt 的长度作为主要存在方式；总共鉴定出了367 个已知的龙眼miRNA， 23 个候选的新miRNA；69 个候选的miRNA 预测到了靶基因，总共对应着约70 个符合靶标特征的基因。进行了龙眼体胚发生过程中miRNAs内参基因的筛选，筛选到的内参基因为dlo-miR159c、dlo-miR159a.1和dlo-miR159a.2。 对20 个miRNAs进行了体胚发生过程的差异表达分析，其中18个miRNA在体胚发生过程中表达量有明显差异，说明与龙眼体胚发育进程密切相关。对部分miRNA进行了外源激素及非生物胁迫下qPCR、转基因等研究。采用PAGE/Northern Blot对候选miRNA进行了实验验证。根据转录组和蛋白组学研究结果，克隆了miRNA前体序列和初级体序列约15条以上, ARF、SOD、RAN、SERK等候选靶基因cDNA全长序列60条以上，并在GenBank上登录。采用qPCR技术分析了至少60个以上靶基因及其家族成员在体胚发生过程中表达规律。本研究比较系统地了解龙眼体胚发生过程miRNA的种类和表达谱，明确参与龙眼体胚发生过程中密切相关的关键miRNA及靶基因，发现miRNA 及其靶基因参与了龙眼体胚发生过程中的基础代谢、激素信号转导、细胞凋亡、氧化胁迫等生理过程，从而最终影响其发育进程，揭示miRNA在体胚发育中的重要调控作用。