梅花鹿茸多肽基因构建、克隆与表达及重组鹿茸多肽促进受损肝细胞修复和再生的作用机制研究

Preliminary studies have proved: 1.The total polypeptides of velvet antler significantly promote the role of repair and regeneration of the damaged liver cells; 2. get a polypeptide named nVAP ( natural velvet antler polypeptides ) which showed a single peak in HPLC chromatography and single band in SDS-PAGE. Its structure was determined by combination of MALDI-TOF MS analyses, N-terminal Edman degradation and amino analyses. It shows that the nVAP consists of a single chain of 32 amino acid residues; 3. nVAP showed significantly increase the proliferation of injury of L-02 cell line by carbon tetrachloride; 4. nVAP showed a single peak in HPLC and it is possible to become a quality marker of the preparations of velvet antler polypeptides. Based on the above results, the project will make the following researchs: 1. To construct genetic engineering bacteria of the nVAP and to establish the system of induced expression and separation and purification and to obtain high purity and yield of recombinant velvet antler(rVAP), and to provide the material basis of quality standards of the preparations of velvet antler polypeptides;2. More in-depth to explore the molecular mechanism of ERS induced apoptosis and regeneration and repair of damaged liver cells by cell models and animal models. And search intervention mechanism and the role of targets of rVAP in this process. These studies will provide a theoretical basis for clinical prevention and treatment of liver disease of velvet antler polypeptides, and to establish the founded of the chemistry and pharmacology of velvet antler polypeptides as the development of new drugs, and to provide new ideas and ways for further development of traditional Chinese medicine resources.

前期研究工作证明：1．鹿茸总多肽具有明显地促进受损肝细胞修复和再生的作用；2．以促受损肝细胞增殖为活性检测指标，从总多肽中分离纯化得到由32个氨基酸残基组成的单体鹿茸多肽（nVAP）；3．该单体多肽结构清楚，促受损肝细胞增殖活性更强；4．采用HPLC可在鹿茸多肽制剂中清晰检测，有可能成为鹿茸多肽制剂质量检测的标识物。本课题拟在上述工作基础上，1．构建该单体多肽的基因工程菌，建立系统的诱导培养条件和分离纯化条件，获得较高纯度和收率的重组鹿茸多肽，为鹿茸多肽制剂质量标准制定提供物质基础；2．采用离体细胞模型和整体动物模型，较深入探讨ERS诱导受损肝细胞凋亡的分子机制及对损伤后肝细胞的再生与修复的影响作用，以及重组鹿茸多肽对这一过程的干预及可能作用靶点。上述研究将为鹿茸多肽临床上预防和治疗肝病提供理论依据，为鹿茸多肽作为新药开发奠定化学和药理学基础，为中药资源的深入开发提供新的研究思路和途径。

在前期的实验研究中，我们从新鲜梅花鹿茸中分离纯化得到了由32个氨基酸残基组成的一个单体多肽，该单体多肽在体外具有很强的促进受损肝细细增殖的活性。在本项目的研究中，我们根据该单体多肽的一级氨基酸组成序列，结合大肠杆菌偏爱密码子表构建了重组鹿茸多肽的基因序列及原核表达工程菌，获得高产率的重组基因工程鹿茸多肽（rVAP），外观为白色絮状物，易溶于水，产率约为6.4mg/L。并深入地探讨了重组鹿茸多肽对内质网应激诱导的肝损伤的保护作用及可能作用机制。在离体细胞实验中，我们发现重组鹿茸多肽对衣霉素诱导的内质网应激所介导的L02细胞（人正常肝细胞系）损伤具有显著的保护作用。重组鹿茸多肽可以明显促进受损L02细胞的增殖，并抑制内质网应激介导的细胞凋亡，其机制可能通过抑制PERK-eIF2a-ATF4信号通路，下调CHOP/GADD153的表达，并抑制内质网凋亡蛋白caspase-12的表达，减轻内质网应激及其介导的细胞凋亡的发生。比较有趣的是，CHOP/GADD153基因的沉默对其上游的PERK-eIF2a-ATF4信号通路没有显著影响，而且重组鹿茸多肽对内质网应激介导的细胞损伤和凋亡的抑制作用不仅仅依赖PERK-eIF2a-ATF4-CHOP信号通路，还与其下调caspase-12凋亡蛋白的表达以及其他凋亡通路有关。这也提示我们，重组鹿茸多肽可能通过多个靶点来促进受损肝细胞增殖并抑制其凋亡，因此，对内质网应激介导的肝细胞损伤具有显著保护作用。在整体动物实验中，我们通过CHOP基因敲除小鼠进一步验证了重组鹿茸多肽在体内的作用，结论与离体细胞实验相一致，对内质网应激介导的小鼠急性肝损伤具有显著的保护作用。综上所述，该课题研究进展顺利，取得了预期实验结果，成功构建了鹿茸单体多肽的基因表达工程菌，建立系统的诱导培养条件和分离纯化条件，获得较高纯度和收率的重组鹿茸多肽，解决了从天然梅花鹿茸中获取该多肽收率较低，成本较高的问题，为进入中试阶段提供实验参考数据，也为鹿茸多肽制剂质量标准制定提供物质基础；同时，分别从离体细胞模型和整体动物模型，较深入探讨ERS诱导受损肝细胞凋亡的分子机制及对损伤后肝细胞的再生与修复的影响作用，以及重组鹿茸多肽对这一过程的干预及可能作用靶点。上述研究将为鹿茸多肽临床上预防和治疗肝脏疾病提供理论依据，为鹿茸多肽制剂最终作为一类新的保肝药物开发奠定化学和药理学基础，