差异分泌组鉴定periostin介导肿瘤细胞与基质细胞间相互作用及机制研究

In this project, we analyzed the protein components in the conditioned medium (CM) of colorectal cancer organ cultures and in the adjacent normal tissue using an iTRAQ labeling-based proteomics approach. Periostin was found to be elevated 9 fold in the secretome of colorectal cancer organ compared to that of normal tissue.. We have proved that periostin, a component of the extracellular matrix, was maily expressed by fibroblasts in the normal tissue and in the stroma of the primary tumour. Proteinase-activated receptor 2 knock-down resulted in down-regulated periostin expression. Activation of β-catenin signaling pathway up-regulated periostin expression. Thus, we presumed that cancer cells may secrete trypsin which can active proteinase-activated receptor 2 in fibroblast, and then trigger β-catenin signaling result in up-regulation of periostin expression. .On the other hand, it has been reported that periostin overexpresion may lead to cancer invasion and proliferation. Infiltrating tumour cells need to induce stromal POSTN expression in the secondary target organ to initiate colonization. POSTN is required to allow cancer stem cell maintenance, and blocking its function prevents metastasis. But the expression level of periostin in metastases is much lower than primary site. So, we made another hyperthesis that periostin, which was secreted by stromal cell, can induce cancer cell EMT and stem cell like properties in primary tumor site..Our data will identify periostin as a factor involved in the interation between cancer cells and stromal cells, and inhibition of tumor-stromal interactions maybe a useful therapeutic approach for colorectal cancer.

本项目直接以临床结直肠癌样本作为研究对象，首次采用组织体外无血清培养联合绝对定量的iTRAQ技术，对肿瘤组织的分泌蛋白质进行定性定量分析。我们的研究显示，periostin在结直肠癌微环境中的含量教正常组织中提高9倍，提示其在结直肠癌发生发展中具有重要作用。前期工作已证明，periostin主要由基质细胞分泌，蛋白酶活化受体2敲降能够下调periostin表达，而β-catenin信号通路显著上调periostin表达。因此，我们推测肿瘤细胞通过分泌蛋白酶trypsin激活基质细胞表面的蛋白酶活化受体2，从而上调periostin的表达，提高肿瘤微环境中periostin的浓度。另一方面，periostin高表达与肿瘤细胞转移潜能上调密切相关，因此我们还将进一步分析其对肿瘤细胞EMT和细胞干性的影响，完善肿瘤细胞与基质细胞相互调控的环路。

肿瘤微环境在肿瘤发生发展中发挥重要作用，探索肿瘤微环境中的特异性蛋白一方面能够为肿瘤的早诊早治提供潜在的标志物，另一方面则可为研究肿瘤发生发展的机制提供研究线索。本项目首先直接以临床结肠癌样本作为研究对象，采用组织体外无血清培养联合绝对定量的iTRAQ技术，对肿瘤组织的分泌蛋白质进行定性定量分析，发现其中POSTN在结直肠癌肿瘤微环境中的含量较正常组织提高9倍，提示其作为标志物的潜能和调控肿瘤发展的作用。因此，本项目针对POSTN对结肠癌发展的机制进行研究，同时对POSTN表达升高的机制进行了探索。. POSTN参与肿瘤细胞干性维持的调控。POSTN是一种分泌蛋白，在正常结肠粘膜中，POSTN主要由基质细胞分泌。而在肿瘤组织中，POSTN则主要由上皮细胞表达。体外实验证明POSTN能够提高肿瘤细胞的体外成球能力，并且该蛋白只在干细胞样的肿瘤细胞中表达。以上提示POSTN对肿瘤细胞的干性维持至关重要。. 本项目还发现trypsin-PAR2信号通路能够调控POSTN的表达。肿瘤干细胞的微环境，即干细胞niche对干细胞的自我更新和维持至关重要。蛋白酶是微环境的重要组成部分，本项目发现trypsin在结肠癌肿瘤总高表达，而其下游的激活受体PAR2在结肠癌组织中同样表达升高，也就是说trypsin-PAR2信号通路在结肠癌发生发展过程中异常活化。而体外实验证明，PAR2敲降则可以降低肿瘤干细胞的比例，证明trypsin-PAR2信号通路的活化与肿瘤细胞干性维持相关。此外，trypsin-PAR2信号通路还能够调控POSTN的表达，当该通路活化时POSTN表达升高。进一步的研究表明，PAR2在转录水平调控POSTN的表达。本项目分析了POSTN的启动子区域，发现存在3个TCF/LEF结合位点，CHIP技术发现beta-catenin和TCF4能够直接结合与POSTN的启动子序列，且当PAR2敲降时，结合能力降低。. 因此，本项目的工作发现了与肿瘤细胞干性维持密切相关的重要分子POSTN，并证明了肿瘤微环境中的trypsin能够作用于肿瘤干细胞表面的PAR2来诱导POSTN的表达，以提高肿瘤细胞的干性维持。