具有抑酶和破膜双重作用NDM-1抑制剂的设计及活性研究

The emergence of 'superbug' have caused global attention. The hydrolytic enzyme produced by the 'superbug' called New Delhi metallo-β-lactamase-1 (NDM-1), which can hydrolyze almost all β-lactam antibiotics. In our previous research work: We have discovered that the thiophene dicarboxylic acid derivatives can inhibit the activity of NDM-1. After coupling thiophene dicarboxylic acid derivatives with antibacterial peptides Pls-α3, new compounds have dual function of enzyme inhibition and membrane damage at the same time (IC50=1.2μM、MIC=32μg/ml). This project intends to further explore the structural optimization, antibacterial effect and mechanism of NDM-1 enzyme inhibitor possessing dual function of enzyme inhibitory effect and membrane damage：⑴ Optimizing the inhibitory activity of new molecular, which the tructure of thiophenedicarboxylic is invariability and the oligopetides and analogues are as side chains, and researching structure-activity relationship. ⑵ Determining MIC values against drug-resistant engineering bacteria. ⑶ Research on the acting mechanism utilizing Apo-NDM-1 and site directed mutagenesis and membrane damage effect using transmission electron microscope (TEM). ⑷ Exploring pharmacological activity on the animal level using the mouse peritonitis model. The implementation of this project can provide new theoretical principle and design thoughts for the research and development of drug against drug-resistant bacteria, and also help to resolve the clinical refractory infections.

超级细菌NDM-1的出现引起全球对细菌耐药的广泛关注，该菌所表达的NDM-1酶能水解几乎所有β-内酰胺类抗生素。我们前期工作发现噻吩二羧酸衍生物具有抑制NDM-1作用，将其与抗菌肽Pls-α3偶联后，新分子同时具有酶抑制活性和破坏细菌细胞膜的双重功能（IC50=1.2μM、MIC=32μg/ml）。本项目拟进一步开展具有酶抑制和膜破坏双重作用NDM-1抑制剂的结构优化、抗菌效应和机制研究:⑴优化母核结构不变，以抗菌寡肽或类似物为侧链的新分子对靶酶的抑制活性、研究其构效关系；⑵测定抑制剂对耐药工程菌的MIC值；⑶用去辅基Apo-NDM-1、定点突变酶中氨基酸研究抑酶作用机制，用透射电镜观察其对细菌细胞膜的破坏机制；⑷以细菌感染腹膜小鼠为动物模型，在体内进行初步药理学研究。这些研究工作不仅可为抗耐药菌药物研发提供新的设计思路和理论依据，也有助于解决临床上难治性的耐药菌感染。

细菌耐药已成为全人类健康的重要威胁，目前临床分离的“超级细菌”越来越多，而正在开发中的新型抗生素却很少。因此，迫切需要开发新型抗型抗菌剂，以应对将来可能出现的公共卫生危机。项目负责人前期研究结果表明，基于不同的机制（抑酶和破膜）的双功能多肽/拟肽具有较好的抗临床多药耐药菌的作用。本项目拟在前期的工作基础上，发现并优化了具有抑酶和破膜双重作用NDM-1抑制肽，并研究了其结构与功能关系，通过丙氨酸扫描发现碱性氨基酸所较为关键，且分子整体的两亲性是其破膜抗菌的关键；另一方面分子中的巯基、游离的羧基是其抑制 NDM-1金属β-内酰胺酶的关键基团。优化后的分子在小鼠感染模型上亦具有较好的治疗作用，且其在高浓度下溶血率<10%，具有进一步开发的价值。在研究的过程中，我们意外的发现了设计的拟肽分子除抗菌活性外，还具有免疫调节活性，其能抑制由脂多糖诱导的鼠源性巨噬细胞RAW 264.7中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-17的表达，促进抗炎细胞因子IL-10的表达。相关成果已申请发明专利6项，其中已经授权4项，已公开2项。项目负责人以第一作者发表SCI论文两篇（FASEB J，IF: 5.391, 二区TOP；Peptides, IF: 2.659），合作发表SCI论文7篇，合作培养硕士研究生1人。以上研究成果为多功能的抗菌多肽/拟肽的设计与开发提供了借鉴和模板分子。