鸡生长与免疫抑制综合征病毒全基因组序列测定及p30蛋白基因研究

鸡生长与免疫抑制综合征（暂定名）是严重危害养鸡业的一种新疫病，病原为病毒，鸡群感染后发病率在80％以上，死亡率10％以上，主要以生长抑制和免疫抑制为特征。经过病毒的理化特性、生物学特性、形态特征研究，免疫学鉴定，分子生物学鉴定，证明该病毒为一种新病毒，可归到疱疹病毒科。在此基础上，利用已经测定的UL38等37个基因片段（共约19kb），采用随机PCR结合特异性PCR方法，进一步克隆和测定病毒的全基因组序列，分析比较本病毒与疱疹病毒科其它病毒的遗传关系，分析病毒基因的特性和主要功能。测定毒力蛋白（p30）C、N末端氨基酸序列，推导出DNA序列，克隆p30基因并测序，以pFASTBAC-HTa作载体，构建重组质粒，在sf9细中胞表达，提取p30表达蛋白，测定其毒力，进行血清中和试验，确定病毒的毒力基因和抗原基因。为进一步研究病毒致病机理、弱毒疫苗、基因缺失疫苗和基因重组疫苗奠定基础。

完成全部研究任务，实现预期目标:.①完成鸡生长与免疫抑制综合征病毒ZZ2004株全基因组序列测定。用随机引物RT-PCR克隆ZZ2004毒株基因，获得一段与IBV基因具有较高同源性的基因，设计引物，RT-PCR，测定全基因组序列。全长为27663nt，A+T含量占61. 74%，528～20434位为RNA依赖的RNA聚合酶基因，编码ORF1a和ORFlb, 20370～27159位主要编码病毒的S、E、M和N结构蛋白。与12株IBV参考毒株的同源率为86.3%～93.7%；5′-UTR、3′-UTR、 1ab、M及N基因与SAIBK、SC021212的同源性均为最高， S1、S2基因与GD毒株的同源性最高。该毒株S1蛋白的氨基酸序列变异最大，与参考毒株的同源率为73.7%～85.9%，其裂解位点的氨基酸序列为RRHRR，不同于其他参考毒株的RRF/SRR；遗传进化树分析，ZZ2004株 S1 、S2与GD毒株亲缘关系最近，M与BJ毒株的亲缘关系较，N和SAIBK毒株亲缘关系最近。结合致病性等研究，证明该病毒为冠状病毒新变异株，对鸡和鸭均能感染致病的冠状病毒为首次发现，命名为鸭源性冠状病毒ZZ2004。.②完成p30蛋白基因研究。测定p30蛋白N末端氨基酸序列，翻译成DNA序列与测定的基因组序列比较，预测为M基因。克隆M基因，构建MpFastBacHTa和MBacmid DNA。将MBacmid DNA转染sf9细胞，培养后，收集sf9细胞培养上清和细胞，SDS-PAGE表明，感染重组杆状病毒的细胞裂解液中在31kDa附近有蛋白条带, sf9细胞和感染bacmid质粒的sf9细胞裂解液中未见此条带。纯化表达蛋白，测定其N末端氨基酸序列，与p30进行比较，证实p30蛋白为M蛋白，位于ZZ2004毒株基因组的24510～25190位置。浓缩纯化的M表达蛋白，制备抗体，进行鸡胚中和试验和ELISA，表明抗M蛋白抗体不能中和ZZ2004毒株的致病作用，但能作为ELISA检测抗体。用100倍浓缩的M表达蛋白经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，结果表明M蛋白对SPF鸡胚无致病作用，不具有毒性。.③成果。发表学术论文12篇；主编出版《家禽免疫抑制病》著作；申请国家发明专利9项，获授权2项；培养博士3名、硕士15名，青年骨干教师5名；7人开展国内外学术交流。