紫花苜蓿逆境相应转录因子NAC基因的分离及其功能的研究

NAC transcription factors are a novel kind plant transcription factors, playing an important role in the plant growth, development and stress responses. It has been proved that different high homologous NAC genes have different functions and characteristics. Therefore, the performance of the NAC genes in different plants is the premise to reveal the NAC family's function. In this project, we intend to clone the NAC genes from the purple alfalfa（Medicago sativa） using RACE method. Then we will utilize the time fluorescence quantitative PCR technology to study the expression of the NAC genes under different stress conditions. At the same time, we plan to creen its downstream target genes by the pull - down technology, and to preliminarily clarify molecular mechanism of the interactions of alfalfa NAC transcription factors and the target genes. Finally, we will further check and verify the functions and expression of the NAC genes in the anti-stress processes by transforming them into tabacco using the transgenic technology. In addition, we want to construct the stess-related cDNA library of purple alfalfa in order to screen more NAC genes, which will lay a foundation for further study of the alfalfa NAC transcription factor family. This research will provide important reference and basis to illustrate the expression regulation mechanism of the NAC genes and the molecular mechanism of alfalfa's resistance; at the same time it can supply theoretical basis and technical support to discover new anti-stress genes.

NAC转录因子是特异存在于植物中的一类新型转录因子，在植物生长发育和胁迫应答过程中发挥重要作用。实验证明，不同物种的高同源NAC基因具有不同的功能特点。因此，研究NAC基因在不同植物中的表现是揭示NAC基因家族功能的前提。本项目以优质牧草紫花苜蓿为材料，拟利用RACE方法，克隆NAC相关基因。然后应用荧光定量 PCR技术，研究苜蓿NAC基因在不同逆境胁迫下的表达规律。同时，应用pull-down技术筛选其下游靶基因，初步阐明苜蓿NAC转录因子和靶基因的互作分子机制。最后通过转基因技术，转化烟草，进一步验证NAC基因在拮抗逆境胁迫过程中的功能和表达模式。另外，拟构建紫花苜蓿逆境相关的cDNA文库，筛选更多NAC基因，为进一步研究紫花苜蓿NAC转录因子家族奠定基础。本研究将为了解NAC家族基因表达调控机理和苜蓿耐逆分子机制提供重要参考和依据，同时为抗逆新基因的发掘提供理论基础和技术支持。

NAC转录因子是特异存在于植物中的一类新型转录因子，在植物生长发育和胁迫应答过程中发挥重要作用。实验证明，不同物种的高同源NAC基因具有不同的功能特点。目前研究较多的主要是拟南芥和水稻等少数模式植物，在豆科牧草紫花苜蓿中鲜有报道。本项目以优质牧草紫花苜蓿为材料，对紫花苜蓿NAC家族转录因子基因进行了克隆与功能研究，通过本项目实施，获得以下结果：利用RT-PCR和RACE技术克隆了3个紫花苜蓿NAC转录因子新基因MsNAC1、MsNAC2、MsNAC3 （Genbank登录号：JN099384、JN099385、KC491186）。系统进化分析表明这三个基因均属于NAC家族的ATAF亚家族，已有研究表明ATAF亚类中的大多数NAC基因都与植物响应环境胁迫有关，因此，推测这三个基因可能参与紫花苜蓿逆境胁迫调控。为了进一步证明上述推测，我们应用real-time PCR技术分析了MsNAC 在紫花苜蓿中的表达特性。结果表明，这三个基因在紫花苜蓿中的表达量受盐、干旱、冷害和脱落酸（ABA）诱导而显著升高，并且在根中的表达量要明显高于在叶中的表达量。接下来，我们利用转基因技术将紫花苜蓿MsNAC基因转入烟草，进一步来验证MsNAC基因的功能，通过对T3代转基因烟草的研究，我们发现转MsNAC 基因的烟草在种子萌发期和幼苗期均表现出比野生型烟草更强的抗逆性。上述内容我们已经发表在《中国农业科学》《西北植物学报》《植物遗传与资源学报》，并申请了2项国家发明专利（专利号：ZL201310717761.4；ZL201310718228.X）。为了进一步探讨这两个基因的调控机理，我们对转MsNAC基因烟草进行了转录组测序，转录组测序结果揭示了MsNAC 基因在盐、干旱和冷害等非生物胁迫下的调控通路，该结果为紫花苜蓿NAC家族转录因子基因功能的深入研究提供了重要信息。最后，我们构建了盐胁迫和冷害胁迫条件下的紫花苜蓿cDNA文库，为后续筛选更多紫花苜蓿NAC基因和与抗逆相关的紫花苜蓿优质基因奠定了实验基础。此部分内容待发表。本研究将为了解NAC家族基因表达调控机理提供重要基础，同时为抗逆新基因的发掘及利用转基因技术提高紫花苜蓿抗逆力提供理论和技术支持。