乙酰胆碱酯酶核酸适体快速筛选的新方法研究

At present, the aptamer-based analytical methods have become hot areas of analytical chemistry. However, aptamer screening has been a bottleneck of the application of aptamer. It is the most important problem in aptamer screening that the complex of oligonucleotide and target and free oligonucleotide are very difficult to separate. Acetylcholinesterase （AChE）is often used as target in environmental contamination detection. So we select AChE as target protein in our research. When AChE combines with its aptamer, the Tm value is different with that of the free oligoucleotide. Thus, the oligonucleotides modified by AChE are extended to form the template of PCR and are amplified by PCR. Therefore, free oligonucleotides are successfully seperated. In addition, we further design oligonucleotides to be a self-complementary structure based on molecular beacon to improve aptamer screening. Finally, we will construct a novel method of AChE aptamer screening. The novel method will be fast and effective for aptamer screening of target protein, and greatly promote the development of analytical detection based on aptamer.

目前，基于核酸适体的分析方法成为分析化学研究的热点领域。但有效的核酸适体太少成为制约核酸适体应用发展的瓶颈问题，而寡核苷酸-靶分子复合物与游离寡核苷酸难以快速有效分离是适体筛选过程中的关键问题。 在本课题中，以水体环境污染的生物标志物乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase）作为靶标蛋白，利用结合乙酰胆碱酯酶的核酸适体和游离寡核苷酸链在杂交时的Tm值的差异，结合靶标的核酸适体有效互补延伸形成模板，随后被PCR复制放大，实现与游离随机寡核苷酸链的快速分离。为了增强筛选的有效性，借鉴分子信标的分子结构，设计随机寡核苷酸链的自身互补结构开关，以加强溶液中开关反应的效率，建立一种新的结合乙酰胆碱酯酶的核酸适体筛选方法。 此方法的建立将对核酸适体的快速有效筛选提供方法学支持，并为建立基于核酸适体的环境分析检测方法奠定分子识别基础。

目前，基于核酸适体的分析方法成为分析化学研究的热点领域。但有效的核酸适体相对较少成为制约核酸适体应用发展的瓶颈问题，而寡核苷酸-靶分子复合物与游离寡核苷酸难以快速有效分离是适体筛选过程中的关键问题。针对这一难点，本课题组选用适体的明星靶标-凝血酶作为目标蛋白分子对筛选过程进行了初步验证。该方法设计一条发卡DNA作为分子开关，该发卡结构的环部含有凝血酶的适体序列，凝血酶与适体序列特异性结合，导致茎环结构发生改变，裸露出的3’端再在两条特异性引物、Nt.Alw I切刻内切酶和Klenow (exo-) DNA聚合酶联合作用下，引发链置换扩增反应，经双重循环扩增后，信号被级联放大，实现对凝血酶的灵敏性检测，检测限达2.6×10-12 mol/L，且在人的血清样本中显示了较强的抗干扰能力和特异性。最终，通过对试验方案及条件的优化初步证明了该技术的可行性。.通过本课题的研究，已经成功构建了一种核酸适体筛选的新方法。在上述研究方法的基础上，以水体环境污染的生物标志物乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase）作为靶标蛋白，借鉴分子信标的分子结构，设计随机寡核苷酸链的自身互补结构开关，对乙酰胆碱酯酶进行了特异性结合的适体筛选。本课题组已筛选到多个结合强度不等的核酸适体候选者，对它们的性质研究和进一步筛选工作目前正在进行。本研究为等温均相检测和适体筛选工作奠定了基础，对其他生物分子的适体筛选提供了新的思路和技术支撑，也将对分子筛选和分子进化等有重要意义。.核酸扩增是适体筛选的基本环节，如何对所得到的有效核酸适体进行高质量扩增是其研究的重要组成部分。因此，本课题对核酸等温扩增方法做了一系列的研究工作，已在 J. Am. Chem. Soc.，Anal. Chem.，Chem. Commun.等高水平学术期刊发表多篇学术论文，并均已标注该基金支持，为构建核酸适体的有效快速筛选提供了新的扩增平台。