自组装囊泡-聚合物整体柱的制备及其在血液中游离肌红蛋白检测中的应用研究

Separation and purification of protein have been a bottleneck for developing proteomic analysis technologies with high sensitivity and high flux. With myoglobin as the model protein, the present study is to develop a method for effective separation of low concentration level of myoglobin in blood samples based on self-assembled vesicle-polymer monolith. The self-assembled vesicles are bonded with the monomer, after which thermal induced in situ polymerization is employed to prepare the self-assembled vesicle-polymer monolith. The structural transfer characteristics of the vesicles in the monolith material and their interactions with myoglobin will be investigated. The selective adsorption and desorption of myoglobin by the monolith are realized by controlling solution conditions. Combined with matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) as the detector, a rapid and sensitive method will be established for the determination of free myoglobin in blood samples. The implementation of this project will expand the applications of polymer monoliths to the pretreatment of biological samples. The present strategy will offer effective reference for the establishment of a platform for the analysis of low concentration level of free protein and peptide in biological samples.

蛋白质的分离纯化是发展高灵敏度、高通量蛋白质组分析技术的瓶颈之一。本项目拟以肌红蛋白作为模型蛋白，利用自组装囊泡-聚合物整体柱实现血液样品中低含量肌红蛋白的高效快速分离，进而实现肌红蛋白的定量检测。将自组装囊泡与聚合物单体偶联，通过热引发原位聚合法制备自组装囊泡-聚合物整体柱材料；研究整体柱材料中自组装囊泡的结构转换特性及其与肌红蛋白的相互作用。通过调控溶液条件实现整体柱对肌红蛋白的高效选择性吸附和洗脱；利用基质辅助激光解吸质谱（MALDI-MS）对肌红蛋白进行分析鉴定，建立血液中游离肌红蛋白的快速灵敏检测方法。本项目的实施将拓展整体柱技术在生物样本预处理中的应用，为建立生物样本中低含量游离蛋白和肽的快速分析平台提供有效的参考。

蛋白质组的复杂性、可变性和多样性给蛋白质研究带来了很多困难，分离纯化技术已成为蛋白质组学发展的瓶颈之一。整体材料具有诸多优点，己被报道用于蛋白质组学研究中，但是整体材料的选择性和分离效率还有待于进一步提高，才能满足蛋白质组学研究对分析技术高灵敏度、高通量的要求。本项目发展了基于聚合物整体柱的高效蛋白质分离富集技术，结合质谱手段，建立了快速灵敏的蛋白质检测方法。项目运行过程中充分完成了任务书中要求的研究目标。1）成功合成了巯基化囊泡，通过巯烯点击反应接枝在聚合物整体柱基质上，所制备的材料在pH值为7.4时呈现球状囊泡形态，而当pH值下降为5.0时囊泡形貌发生变化，快速转变为纤维管形态，实现了在不同pH条件下的囊泡-纤维管之间的可逆转换。2）成功将自组装囊泡-聚合物整体柱用于人血液样品中肌红蛋白的检测应用，优化了萃取过程中各操作步骤的实验条件，设计了基于功能化环糊精自组装囊泡的聚合物整体微萃取平台，建立了自组装囊泡-聚合物整体柱微萃取方法。与质谱联用，考察了自组装囊泡-聚合物整体柱的富集能力，测定得到方法的检出限低达0.1 fmol，日内与日间精密度分别为2.3%和3.5%。另外，通过半定量混合糖蛋白与非糖蛋白的方法考察了改性后整体柱对糖肽的选择特异性。在实际样品分析中，通过依赖性分析与糖肽的搜库软件分析，鉴定到血液中166个N-糖基化位点和对应的130种糖蛋白。3）本项目积极拓展了聚合物整体柱在蛋白质组学领域中的应用，设计了基于环糊精-花生凝集素、环糊精-赖氨酸、环糊精-糖簇、环糊精自组装分子管等功能化的聚合物整体柱，并结合质谱检测手段，用于生物样本中低含量蛋白的高选择性、高灵敏度的检测。