电压依赖阴离子通道1（VDAC1）参与结蛋白病线粒体异常的机制研究

Desminopathy is a kind of hereditary protein aggregate myopathy caused by mutations in the desmin gene. Mitochondrial abnormality in the myocytes is one of early pathological characteristics of desminopathy, while its underlying pathogenesis is not completely clear and additional studies are required. Voltage-dependent anion channel 1 (VDAC1) is one of important subunits constructing mitochondrial permeability transition pore (PT pore). When the permeability of PT pore increased, multiple mitochondrial apoptogenic factors would be released into the cytosol, leading to the activation of mitochondrial induced-apoptosis cascade. There are several evidences demonstrating the interaction between cytoskeletal proteins and VDAC1. In our preliminary study about desminopathy, several mitochondrial abnormalities were related to VDAC1 dysfunctions, which indicated that desmin might directly interact with VDAC1. Therefore, we plan to construct GST recomninant VDAC1, and then determine the interaction domain between desmin and VDAC1 through GST pulldown, co-immunoprecipitation, and overlay immunoblot. Meanwhile, in order to explore the permeability of mitochondrial PT pore when the expression level of desmin and VDAC1 change, we establish several cell and animal models by expression vector transfections, RNA interference, adeno-associated virus mediated vectors injections. Making clearly the situation of mitochondrial dysfunction and mitochondrial induced-apoptosis cascade in desminopathy, it will shed light on the drug development of protein aggregate diseases.

结蛋白基因突变导致的结蛋白病是一种遗传性蛋白聚集性肌病，线粒体异常是结蛋白病最早发生的病理改变之一，然而导致线粒体异常的机制目前尚不完全清楚。电压依赖阴离子通道1（VDAC1）是线粒体渗透转化孔（PT孔）的重要组成亚基，当PT孔通透性增高时，大量细胞凋亡因子从线粒体基质中释放，导致细胞凋亡级联反应。细胞骨架蛋白对VDAC1有重要的调控作用，我们在结蛋白病的前期研究中发现：结蛋白和VDAC1可能存在直接的蛋白作用。本研究拟通过构建GST融合蛋白的方法，采用免疫共沉淀和重叠蛋白印迹等技术，进一步验证和确定结蛋白和VDAC1直接作用的结构域。同时采用多种表达质粒、RNA干扰和腺病毒包装质粒进行多种细胞和动物实验，检测结蛋白和VDAC1表达改变后，线粒体PT孔通透性改变规律，检测线粒体功能改变和线粒体介导的细胞凋亡级联反应。本研究将进一步揭示结蛋白病细胞内线粒体异常的机制，也为药物研发提供新靶点。

结蛋白病(desminopathy)是由位于2q35的结蛋白基因突变导致的一种遗传性骨骼肌心肌病。结蛋白病的主要病理改变为肌原纤维结构的破坏、Z盘紊乱、肌纤维内出现蛋白质沉积，以及线粒体功能异常，而线粒体异常是结蛋白病最早出现的病理改变之一。然而结蛋白病中线粒体异常的机制尚未完全阐述清楚，为此本课题拟研究的内容围绕结蛋白和线粒体VDAC1相互关系为基础，探索结蛋白如何影响VDAC1通道的功能，探讨线粒体PT孔通透性改变和细胞凋亡对结蛋白病发病机制的影响。通过临床研究我们进一步诊断了4个结蛋白病家系和1个ZASP相关性肌原纤维肌病，拓展了肌原纤维肌病的临床表型、病理表型、基因表型的谱系。在临床研究的基础上，我们建立了S12F突变患者的肌母细胞株，运用二维蛋白电泳技术构建了该细胞模型的线粒体蛋白组学数据库，分析显示结蛋白突变肌细胞中线粒体PT相关蛋白表达显著异常，并证实PT孔的通透性增高，ROS的水平增高，进而促进肌细胞凋亡，并且在动物模型水平观察了Bax/Bcl-2蛋白家族与PT孔调节的关系。我们构建了GST-VDAC1和不同结构域的结蛋白质粒表达，进行蛋白作用研究，然而研究显示GST-VDAC1蛋白和不同结构域的结蛋白质粒表达的蛋白之间没有发生直接的蛋白作用，人工合成不同的VDAC1和结蛋白短肽段在醋酸纤维素膜上进行结合实验显示两者之间也没有发生直接作用，因而提示VDAC1蛋白和结蛋白可能没有直接作用结构域。在蛋白组学的提示下，我们发现VDAC1和alphaB-晶格蛋白以及βII-tubulin存在直接作用，而结蛋白又与alphaB-晶格蛋白以及βII-tubulin存在直接作用，因而结蛋白通过alphaB-晶格蛋白或βII-tubulin作用于VDAC1，进而对线粒体PT孔进行调节。该课题初步揭示结蛋白在细胞内和其他骨架蛋白或者伴侣蛋白作用，进而与线粒体VDAC1蛋白发生作用。在结蛋白突变的肌细胞内，由于结蛋白细丝的紊乱，导致以VDAC1蛋白为核心的线粒体PT孔开放和关闭障碍，进而导致线粒体氧化应激水平显著升高，促发线粒体介导的凋亡过程。该研究初步揭示了结蛋白病细胞内线粒体异常的机制，为结蛋白病的治疗提供了新的思路。