经鼻给予重组腺病毒携带TALEN序列原位敲除BDNF-AS基因治疗缺血性脑卒中

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) promotes brain self-repair after ischemic stroke while BDNF-AS, a long non-coding RNA, inhibits its expression. Because many oligonucleotides such as siRNA could only inhibit the expression of BDNF-AS temporarily, it is necessary to knock out the BDNF-AS gene to sustain the low copy of BDNF-AS. However, it is difficult to knock the specific gene in situ in vivo. Recently, transcription activator-like effector nuclease (TALEN) has been developed to knock out any specific gene due to its specific DNA binding domain and non-specific FokⅠendonuclease which only cut the DNA through the dimer. Hence, people needs to transfect two TALEN plasmids into the cells simultaneously which leads to low efficiency of transfection and severe adverse effects. A single chain carrying two Fok I domain could solve this problem. Moreover, the exogenous molecule especially the large weigh molecule cannot cross the intact blood brain barrier. Intranasal delivery of therapeutics could get into the central nervous system bypassing the blood brain barrier. The aim of this project is to develop a single chain TALEN targeting BDNF-AS gene and intranasal delivery of recombinant adenovirus vector carrying the single chain TALEN to treat experimental stroke.

脑源性神经营养因子(BDNF)是促使缺血性卒中后脑组织自身修复的关键分子，但BDNF-AS(一种长链非编码RNA)却抑制其表达。从RNA水平抑制BDNF-AS由于基因不断转录形成新的RNA而变得困难或代价高昂。传统基因敲除因难以解决在体原位特异性敲除基因而无法用于临床，最近发展TALEN技术解决了这一难题。但经典TALEN技术因所含的FokI核酸内切酶需形成二聚体才起作用而需要细胞同时转染两个TALEN质粒，导致基因敲除效率低等。单链TALEN技术克服这一缺点。但血脑屏障阻止大分子进入脑组织内发挥作用，我们前述研究证实经鼻给予大分子能快速有效地进入脑组织。因此，本项目旨在开发重组腺病毒载体携带针对BDNF-AS的单链TALEN序列并经鼻给予治疗缺血性脑卒中。

研究背景：脑源性神经营养因子(BDNF)是促使缺血性卒中后脑组织自身修复的关键分子，但BDNF-AS却抑制其表达。传统基因敲除因难以解决在体原位特异性敲除基因，TALEN 技术解决了这一难题。但血脑屏障阻止大分子进入脑组织内发挥作用，经鼻给药能快速有效地进入脑组织。本项目旨在开发重组腺病毒载体携带针对BDNF-AS 的单链TALEN 序列并经鼻给予治疗缺血性脑卒中。主要研究内容：本项目共分为6个主要部分，分别是重组腺病毒Ad-BDNFAS-scTALEN；重组腺病毒携带TALEN 序列体外抑制BDNF-AS 表达；抑制BDNF-AS 表达保护OGD后神经元；经鼻给予重组腺病毒携带TALEN 序列在脑组织内抑制BDNF-AS表达；经鼻给予重组腺病毒Ad-BDNFAS-TALEN 治疗缺血性脑卒中；抑制BDNF-AS的表达通过上调BDNF 水平产生保护作用。 重要结果和关键数据：( 1)LncRNA在卒中后病理生理机制中发挥重要作用。(2) TALEN质粒可敲除BDNF-AS的表达 构建TALEN质粒，用于特异性敲除BDNF-AS的TALEN质粒，并在体外培养的神经元和293T细胞中进行验证，验证结果显示TALEN可降低BDNF-AS的水平。 (3) 经鼻给予病毒可分布在脑组织内 我们利用携带LacZ蛋白的重组HSV-1病毒，经鼻给予大鼠，然后染色，发现LacZ基因广泛表达在大脑卒中的各位部位，如皮层，海马，丘脑，小脑和脑干等。(4) 抑制BDNF表达可治疗缺血性卒中miR-7的表达与BDNF负相关，抑制miR-7的水平显著维持BDNF的表达，进一步保护神经元。除了3’-UTR区域可以调控BDNF的作用外，我们用EGR1来调控BDNF的启动子的表达。我们结果显示EGR1可以调控体内外的BDNF基因表达。调控BDNF表达可以在体内外保护神经元免受缺血的损伤。科学意义：本项目使用TALEN 原位在体特异性地敲除BDNF-AS 基因，干扰其在缺血性卒中后的表达；本项目采用经鼻给予重组腺病毒的方式将TALEN 序列无创有效地携带进入脑组织内。