基于磁性纳米金生物条形码技术检测中药材中黄曲霉毒素B1的研究

The aflatoxin B1 (AFTB1) is a strong carcinogenic activity substances, herbal medicines if stored improperly very easily affected by pollution, thereby seriously threat to the health of people. AFB1 content requirements become more stringent by governments, and promote the continuous development of the AFTB1 detection, rapid detection technology. The project intends to build a high sensitivity detection AFTB1 methods by nanoparticles-bio-barcode, expect increased by 5-6 orders of magnitude than the GB method detection limit. New method will be connect AFTB1 polyclonal antibody with specific DNA chains labeled gold nanoparticles probe (NP) and AFTB1 monoclonal antibody labeled magnetic micropheres probe (MMP), formed sandwich complexes of MMP-AFTB1-NP, and then utilized tothe hybrid will be released from the NP probe labeled DNA chains, the release of the DNA chains identified by PCR methods to determine the existence and content of the AFTB1. With the development of the internationalization of Chinese medicine, the detection of AFTB1 in Chinese herbal medicine is particularly important, while not yet been established testing standards. The goal of the project is to built a high sensitivity for the detection of trace AFTB1 in Chinese medicine,in order to meet the international standard limits.

黄曲霉毒素B1(AFTB1)是强致癌物质，中药材若存贮不当很容易受此污染，严重威胁人们身体健康。各国政府对AFB1含量限制要求越来越严格， 推动了AFTB1检测特别是快速检测技术的不断发展。本项目拟建立快速高灵敏度的检测AFTB1的纳米粒子-生物条形码新方法，期望比国标法检测限提高5-6个数量级。新方法将AFTB1的多抗、特异DNA 链标记的金纳米颗粒探针(NP) 和AFTB1单抗标记的磁性微球探针(MMP) , 形成MMP-AFTB1- NP 三明治复合物后, 再利用去杂交将NP 探针上标记的DNA 链释放出来，通过PCR检测方法鉴定释放的DNA链, 确定AFTB1的存在及含量。随着中药国际化的发展, 中药材中AFTB1的检测显得尤为重要, 而目前尚未建立相关检测标准。本项目的研究旨在解决目前AFTB1检测技术灵敏度不能满足国际限量标准，常常遭受技术性贸易壁垒的问题，以提高检测灵敏度。

黄曲霉毒素是黄曲霉、寄生曲霉和特曲霉产生的次级代谢产物，在目前已发现的黄曲霉毒素中，因AFB1因毒性最强、分布最广、含量最高，被称为第一大类致癌物。因此，研发出一种快速、准确、高灵敏度、高选择性、高通量的黄曲霉毒素分析检测技术和方法显得尤为重要。.本研究的内容是通过制备AFB1的多克隆抗体和单克隆抗体，建立以此为基础的生物条形码检测技术，对中药材中的AFB1进行分析。内容主要包括AFB1人工抗原的合成及鉴定、AFB1多克隆抗体的制备及鉴定、AFB1单克隆抗体的制备及鉴定、生物条形码检测技术的建立。.首先，采用胺甲基化反应法将AFB1分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白结合形成偶联物AFB1-BSA、AFB1-OVA，用紫外全波长扫描和SDS-PAGE对人工抗原进行鉴定，AFB1-BSA和AFB1-OVA偶联比分别为10.91:1和6.12:1，表明人工抗原合成成功。其次，利用偶联成功的人工抗原AFB1-BSA免疫新西兰大白兔获得抗血清，采用iELISA法测抗血清效价，饱和硫酸铵盐析沉淀法对抗血清进行纯化，优化ELISA法反应条件并建立AFB1标准曲线，回归方程为y=0.1173x-0.1234，r=0.9993，检测限为8.861 ng/mL。将AFB1-BSA免疫BALB/c小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合形成杂交瘤细胞，采用有限稀释克隆法获得三株能稳定分泌抗AFB1-McAb的杂交瘤细胞，分别命名为B1SS5E、B1SS7D、B1SS4H，并用腹水诱生法大量生产McAb。最后，以AFB1多克隆抗体标记金纳米颗粒，再连接互补探针NP链和条形码DNA链制备NP探针；AFB1单克隆抗体修饰磁珠制备MMP探针；将二者与AFB1形成“MMP-AFB1-NP”三明治结构，并在高温低盐的环境下获取条形码DNA链，用FQ-PCR对其进行检测，建立基于AFB1多抗和单抗的生物条形码检测技术。结果显示，在DNA拷贝数为10(sup)15-10(sup)11拷贝/µL范围内Ct值与相应起始模板拷贝数之间存在线性关系y=-2.9054x+54.581，r=0.9991。批间批内重复性好，灵敏度为10 ag/mL，AFB1与AFB2、AFG1、AFG2因为结构太过相似，有一定的交叉反应。利用建立的生物条形码技术对中药材中的AFB1进行了初步测定，结果与HPLC一致。