内皮细胞中的Calpain1/2在异种心脏移植的延迟性排斥反应中的作用研究

Activation of endothelial cells is the key link in delayed rejection reaction. Inhibition of activation in endothelial cells prevents delayed rejection. Previous researches suggest that disruption of calpain1/2 reduce generation of ROS in endothelial cells. Calpain1 and calpain2 regulate the interactions of lymphocytes and endothelial cells by MAPK/ERK signal. We previously showed that deletion of endotheliocyte calpain4 effectively inhibited the protein expression of calpain1 and calpain2 in endothelial cells. When hearts from the transgenic mice were transplantated into rat, mean survival time of grafts were significantly prolonged. At the same time, the concertration of inflammatory factors were decreased in grafts from calpain4 knockout mice. It highlights inhibition of calpain1/2 in endothelial cells improves the function of graft and reduces inflammation , thereby prolong the survival time of graft. But the main mechanism is not clear. The objective is to clarify the role of endotheliocyte calpain1/2 involved in xenograft rejection through MAPK / ERK signaling. The main methods include adenovirus and crispr/cas9 knockout plasmid transfection and cardiac xenotransplantation model with hearts from calpain4 knockout mice. We will refine the new theory in delayed xenograft rejection.

内皮细胞活化是延迟性排斥反应发生的中心环节，抑制内皮细胞激活有助于降低延迟性排斥反应。研究提示：抑制Calpain1/2活性后可以减少内皮细胞内ROS产生，通过MAPK/ERK信号，减少淋巴细胞与内皮相互作用，提高血管内皮功能。我们前期发现内皮细胞特异性敲除Calpain4后可以有效抑制内皮细胞中Calpain1/2表达，将该转基因小鼠的心脏移植到大鼠体内后，移植心脏存活时间明显延长，同时炎症因子表达明显降低。由此推断：抑制内皮细胞中的Calpain1/2后，内皮细胞功能改善，心脏移植物存活时间延长。但是具体机制不明确。本项目将以Calpain4敲除转基因小鼠心脏作为供心，构建异种心脏移植模型。采用腺病毒以及Crispr/Cas9 knockout质粒转染等方法，证实Calpain1/2通过MAPK/ERK信号通路调控内皮细胞在移植排斥中的作用，为异种移植的延迟性排斥反应提供新的理论。

内皮细胞活化是延迟性排斥反应发生的中心环节，抑制内皮细胞激活有助于降低延迟性排斥反应。课题项目设计以Capns1敲除转基因小鼠心脏作为供心，构建小鼠-大鼠异种心脏移植模型。采用腺病毒转染方法，证实Calpain1/2通过 Iκ B/ β-catenin信号通路调控内皮细胞在移植排斥中的作用。经研究发现，（1）在小鼠-大鼠异种心脏移植模型中，应用免疫抑制剂来氟米特，促进小鼠供心存活时间，Capns1KO小鼠供心的存活时间明显长于野生型小鼠;（2）病理学检测发现野生型的小鼠心脏病理切片出现明显的弥散性微血管内凝血、间质出血水肿、炎性细胞浸润，包括中心粒细胞，单核细胞和淋巴细胞，以及微血管栓塞等典型的DXR特征，而内皮细胞Capns1KO小鼠上述DXR的表现明显减轻;（3）体外实验中，构建腺病毒Ad-CAST或者对照Ad-gal，转染至MCECs，加入50%的大鼠灭活血清培养基，模拟体外异种排斥反应，在对照组加入正常10%FBS的完全DMEM培养基，继续培养24小时后，通过Calpain activity kit试剂盒和Western-blot检测Calpain底物Spectrin的表达分别来检测内皮细胞Calpain活性情况。结果显示，在大鼠灭活血清的刺激下，小鼠MCECs细胞内Calpain活性明显提升，而外源性转染Calpastatin可减少大鼠血清对内皮细胞的Calpain活化; （4）Calpain活性抑制可减少内皮中细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）的表达水平，同时保护内皮细胞的形态完整。体外TNF-α作用于内皮细胞能够激活内皮细胞，诱导细胞内Calpain活性提高，上调ICAM-1和VCAM-1的表达，并促进内皮细胞增殖，迁移和成管能力。TNF-α对内皮细胞的激活作用有赖于细胞内Calpain的活性，这与Calpain剪切I-κB，上调β-catenin的表达作用有关。结论：异种移植DXR时期，诱导内皮细胞中Calpain的活性增加，上调细胞内黏附分子（ICAM-1和VCAM-1）的表达水平，促进内皮细胞的激活，增强内皮细胞对炎性细胞的趋化及黏附。而Calpain活性抑制能后够抑制内皮细胞激活，减少移植物中的炎性浸润，延长移植物的存活时间。