苹果实生树个体发育不同阶段的蛋白质差异表达分析

多年生木本被子植物的个体发育过程分为童期、成年营养生长期和生殖生长期三个阶段，目前阶段转变的生理与分子机制尚不清楚。申请人已经找到了苹果实生树童期结束和生殖生长期起始的临界点，筛选到了不同发育阶段的激素、多酚等标记，并已通过SDS-PAGE检测到了阶段转变差异蛋白质谱带的存在。本项目采用2-DE DIGE、串联质谱和生物信息学方法分析苹果实生树不同个体发育阶段蛋白质的差异表达，分别制备部分差异表达蛋白质的多克隆抗体和寡聚核苷酸探针，通过ELISA和RNA Blot方法对差异表达蛋白质及其编码mRNA进行验证；再用免疫组化法和RNA原位杂交技术分析差异表达蛋白质及其编码mRNA的时空表达特性。对认识植物个体发育过程中基因表达和调控有意义。

以苹果杂种实生树（‘红玉’ב金冠’） 02-18-034为试材，通过差异荧光差异凝胶电泳双向电泳（DIGE），检测到差异表达蛋白质点122个，其中，童期、成年营养生长期和生殖生长期特异蛋白质点分别为44个、17个和29个。经MALDI-TOF-TOF质谱鉴定得到95个蛋白质点。23个光合相关蛋白质表现为童期丰度高，暗示着童期光合活性强于成龄期。10个与蛋白代谢相关的酶和辅因子在成龄期高丰度表达，表明阶段转变过程中蛋白代谢加强。30个蛋白质点系由6种蛋白质经翻译后修饰而来。利用蛋白印迹和免疫组织化学法及RT-PCR方法对特异蛋白质S6PDH在‘红玉’ב金冠’和‘紫塞明珠’ב富士’各3株实生树上验证。. 通过碱性磷酸酶处理和Pro-Q Diamond 荧光染色，在阶段转变过程中分离鉴定了107个差异磷酸化蛋白质点，其中 55个Rubisco大亚基，27个Rubisco activase和25个β-tubulin的丰度和磷酸化度不同个体发育阶段均存在显著变化。. 用同一株杂种实生树样品建立SSH童期和成年期的消减文库，分别获得童期和成年期特异表达EST 85个和103个。6个脂类代谢和7个次生代谢相关的EST只在成年期出现。32个蛋白质代谢相关EST中有62.5%在成年期特异出现。5个与Auxin，GAs，ABA和ETH响应相关的EST均只出现在童期。参与氧化还原反应的基因在童期和成年期不同。4个编码Rubisco小亚基rbcS的EST，均与MDP0000731480的3’ UTR序列匹配。其中3个EST 在童期上调表达，1个EST在成年期上调表达。这4个EST仅在3’ UTR 序列上存在差异。4个位于MDP0000243585上的编码金属硫蛋白like的EST和2个编码NADP-甘油醛磷酸脱氢酶的EST的3’ UTR序列也表现出显著差异。用qPCR对2个组合各3株实生树样品对随机选取的差异表达基因验证。通过半定量PCR对存在3’UTR 的差异修饰的4个rbcS EST验证。. 本研究表明，苹果实生树阶段转变过程中不仅存在转录水平的调控，也存在转录后水平上的调控；激素响应、氧化还原调控、次生代谢和蛋白质代谢均与苹果阶段转变密切相关。阶段转变过程中蛋白质磷酸化存在显著变化。