胃肠安通过靶向ARHGAP25抑制大肠癌侵袭和转移的机制研究

The incidence and mortality of colorectal cancer is increasing year by year, which is one of the most common malignant tumors in our country. Metastasis is the primary cause of death. .Based on the basic consensus of “spleen deficiency of colorectal cancer”, in the basis of the spleen of compound “Weichang’an” clinical efficacy and preliminary studies found that it could significantly inhibit the growth of tumor and metastases. In this project, we identified the metastasis related target gene by RNA-seq sequencing technology, and ARHGAP25 as the research breakthrough point. To reveal the role and mechanism of ARHGAP25 in the invasion and metastases of colorectal cancer, and to investigate the mechanism of “Weichang’an” inhibited the invasion and metastases of colorectal cancer by targeting ARHGAP25, utilize in vivo and in vitro experiments, biological information forecasting, confocal laser co localization and co immunoprecipitation technique. This project rounds the function of ARHGAP25 gene and its regulation of the downstream signaling pathways of colorectal cancer, to explore the key points of “Weichang’an” suppressed colorectal cancer metastases, partly reveal the discipline of spleen method treats colorectal cancer, enrich and develop the science connotations of “spleen deficiency of colorectal cancer”.

大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势，其中大部分患者死于远处转移。.基于对“大肠癌脾虚”病机的基本认识，在健脾为主的复方胃肠安临床疗效确切和实验研究发现其有较强的体内抑瘤和抗转移作用的基础上，本项目通过RNA-seq测序技术确定转移相关靶基因，以ARHGAP25为研究切入点，采用体内、体外药物实验、生物信息学预测、激光共聚焦共定位、免疫共沉淀技术等方法，探讨ARHGAP25在大肠癌侵袭和转移中的作用与相关机制；研究胃肠安通过介导ARHGAP25基因的表达来抑制大肠癌侵袭和转移的分子机制。本研究围绕ARHGAP25基因的功能及其对大肠癌发生发展的下游调控机制来探究胃肠安抗大肠癌侵袭转移的关键点，部分揭示健脾法治疗大肠癌的规律，丰富和发展了“大肠癌脾虚”理论的科学内涵。

本研究前期筛选出大肠癌侵袭和转移的相关基因ARHGAP25，扩大样本量加以验证，并通过TCGA和GEO数据库得到进一步确认。运用GSEA软件中的队列分析，表明ARHGAP25的表达与Wnt/β-Catenin 通路激活呈负相关。本研究共纳入有完整随访资料的大肠癌组织样本164例，利用统计软件R进行相关性分析，显示患者的生存期与ARHGAP25的表达、病理学类型、癌结节、远处转移等有关。.本研究从实验动物和细胞开展研究。首先筛选出ARHGAP25低表达的大肠癌细胞株RKO和HCT116，建立过表达细胞系。运用CCK8法检测细胞增殖，Transwell实验观察细胞迁移和侵袭能力，并检测MMPs、EMT标志物和β-catenin的表达。运用 Real-time PCR和Western blot方法验证不同浓度和不同时间点的胃肠安对细胞中ARHGAP25的影响。建立裸鼠大肠癌原位移植瘤模型，观测ARHGAP25过表达和胃肠安对原位肿瘤及实质脏器与腹膜、腹壁转移的影响；并做相应的分子生物学分析。 .体外实验发现：与对照组和空载体组相比，ARHGAP25过表达明显抑制RKO和HCT116细胞的体外增殖（P均＜0.01）；明显抑制细胞的迁移和侵袭（P均＜0.01）。不同浓度的胃肠安处理HCT116细胞，均可明显抑制细胞的增殖能力，显著上调ARHGAP25 mRNA和蛋白的表达，并随着浓度的升高抑制增殖能力和上调ARHGAP25表达的能力逐步升高。胃肠安可明显抑制细胞的迁移与侵袭能力（P均=0.000）。ARHGAP25过表达、胃肠安可以显著抑制MMPs（MMP7、MMP9）、EMT标志物（ZEB1）和β-catenin的表达。体内实验发现：ARHGAP25过表达可以显著抑制原位肿瘤生长，抑瘤率88.03%，胃肠安120mg/ml、240mg/ml分别为22.79%、51.48%；胃肠安可以上调原位肿瘤中ARHGAP25的表达，抑制肿瘤的实质脏器和腹壁、腹膜的转移。.本研究显示ARHGAP25与大肠癌侵袭转移具有相关性，明确以健脾为主的胃肠安对ARHGAP25的影响及抑制大肠癌侵袭转移的作用，揭示胃肠安通过靶向ARHGAP25抑制结直肠癌侵袭和转移的分子机制。该研究有助于揭示健脾法治疗大肠癌的规律，为后继深入研究奠定基础，具有一定的学术意义。