番茄果实成熟的磷酸化蛋白质组学研究

Tomato is an important vegetable crop. As the model for climacteric fruits, tomato fruit ripening has been extensively studied at the physiological, biochemical, molecular and genetic levels. Ethylene plays a major role in controlling fruit ripening and fruit quality. But much still has to be characterized for fruit ripening and ethylene signaling in theory and application. Post-translational modifications, such as protein phosphorylation and ubiquitination, play an important role in ethylene signaling and fruit ripening. But phosphoroteomics studies on fruit ripening and ethylene signaling have not been reported. Here, by extracting total proteins and purifying phosphoproteins using GaCl3-based immobilized metal affinity column, in fruits of mature green and breaker stages of tomato lines Ailsa Craig and ethylene response mutant (Never ripe), two complementary quantitative proteomics methods (2-D DIGE or 2-D Difference gel electrophoresis and iTRAQ or isobaric tags for relative and absolute quantitation) are used to identify a large number of ripening and ethylene-regulated phosphoproteins. And further characterization of a few proteins will be performed. This study will help identify novel fruit ripening and ethylene signaling factors, and will provide novel insight for the molecular mechanism of ethylene signaling during fruit maturation and senescence.

番茄是重要的蔬菜作物，作为呼吸跃变型果实的模式，番茄果实成熟在生理、生化、分子以及遗传水平已有深入研究。乙烯是调控番茄果实成熟及品质的关键因子。在生产和理论上，关于番茄果实成熟以及乙烯调控仍有不少需要进一步阐释的问题。在乙烯信号传递和番茄果实成熟中，蛋白翻译后修饰，尤其是磷酸化和泛素化起着重要的作用。果实成熟以及乙烯对磷酸化蛋白调控的蛋白质组学研究尚无报道。我们将以野生型番茄Ailsa Craig和乙烯受体突变体Never ripe绿熟期和破色期的果实为材料提取总蛋白，然后采用氯化镓为基础的固化金属离子亲和层析纯化磷酸化蛋白，利用结果互补的两种蛋白质组学定量方法（荧光差异双向电泳技术和同位素相对标记与绝对定量技术），鉴定一批受果实成熟和乙烯信号调控的磷酸化蛋白，并对其中的几个蛋白进行进一步生化鉴定。本项目有助于挖掘新的果实成熟和乙烯调控因子，丰富乙烯信号转导在果实成熟和衰老中的分子机理。

植物激素通过改变信号蛋白含量或者翻译后修饰状态（如磷酸化、泛素化等）来传递信号，调控植物生长和发育，包括果实成熟和衰老。我们认为研究信号蛋白的含量和修饰状态能更深入揭示激素在果实成熟中的功能。基于此假设，我们利用果实成熟研究模式植物番茄，在蛋白质组学水平研究果实成熟中蛋白及其磷酸化状态的动态变化。经过对番茄果实中磷酸化肽段富集技术的优化，成功鉴定到超过1万多种蛋白质和3万多种磷酸化肽段，是目前已知数量最多的研究结果。定量结果表明，在番茄果实成熟中，乙烯、ABA和油菜素甾醇等激素的某些信号蛋白发生磷酸化或者去磷酸化。此结果与这些激素以前相关报道一致，例如：检测到油菜素甾醇信号蛋白BSK1、CDG1和BSU1的磷酸化以及BIN2和BZR1的去磷酸化，乙烯信号传递中ETR4、CTR2以及EIN2的去磷酸化，油菜素甾醇信号因子BIN2和BZR1的去磷酸化等，以及ABA信号途径CPK、SnRK2和bZIP蛋白的磷酸化。此外，一些信号蛋白在果实成熟过程中的含量及翻译后修饰状态的改变，在乙烯受体突变体Nr中受到抑制，表明乙烯调控其他激素在果实成熟中的功能。另外，研究结果表明，番茄成熟主要调控因子，如RIN、NOR、CNR均为磷酸化蛋白。因此，研究果实中信号蛋白的含量及修饰状态变化，将和研究激素的含量或者激素应答基因表达水平等方法一样，是研究激素在果实成熟中功能的有效手段。