miR-19b靶向TNFα介导人参皂苷Rh2衍生物诱导肿瘤细胞凋亡的表观遗传机制

前期研究发现ERα/ERβ在介导G-Rh2及其衍生物激活TNFα并诱导肿瘤细胞凋亡、发挥广谱抗肿瘤效应中起关键作用，运用miRNA芯片技术发现G-Rh2衍生物（G-Rh2-d）能明显下调靶向TNFα 的miR-19b的表达。为进一步分析G-Rh2-d下调miR-19b激活TNFα的作用机制，本课题拟采用甲基化特异性PCR、qRT-PCR等技术分析G-Rh2-d影响miR-19b启动子甲基化和组蛋白去乙酰化对miR-19b表达的影响；运用EMSA和荧光素酶报告基因法，鉴定ERα/ERβ对 miR-19b的特异调控；运用荧光素酶报告基因活性分析结合Western blot、qRT-PCR 技术深入验证miR-19b对靶基因TNFα的调控。有望揭示miR-19b如何介导G-Rh2-d激活TNFα诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制，为G-Rh2-d广泛应用于临床治疗肿瘤提供理论和实验依据。

前期miRNA芯片研究发现G-Rh2衍生物能明显下调靶向TNFα 的miR-19b的表达。为进一步分析G-Rh2衍生物下调miR-19b激活TNFα的作用机制，本课题以人乳腺癌MCF-7细胞系为模型，运用DNMT甲基化转移酶检测到随着PPD浓度增加，DNMT甲基化转移酶的活性不断增加；Real-time PCR、RT-PCR实验发现随着PPD药物浓度的增加，miR-19b的表达量逐渐降低，加入去甲基化药物5-Aza-CdR（100μM） 和PPD（IC50）之后，发现miR-19b的表达与仅加入PPD（IC50）之前相比，miR-19b的表达显著回升，说明原人参二醇PPD能增强甲基化转移酶的活性，抑制miR-19b的表达。进一步通过焦磷酸测序的方法定量对miR-19b 启动子区4段序列中的5个CPG岛位点的甲基化程度进行测序分析，研究结果发现其中两个位点的甲基化程度不明显，另三个位点明显发生了甲基化，但差异不明显。为进一步验证miR-19b对靶基因TNFα的调控，本研究通过转染 miR-19b模拟物(mimic)，使其表达上调，通过Western blot检测TNFα表达量的变化，发现上调miR-19b之后，TNFα的表达量下降，加入药物PPD之后miR-19b的表达明显下调，说明原人参二醇PPD可以抑制miR-19b的表达，从而上调TNF-α的表达诱导肿瘤细胞凋亡。在细胞水平上，通过集落形成实验发现G-Rh2对MCF-7生长的抑制呈浓度依赖性效应；应用划痕实验及侵袭实验发现G-Rh2能够抑制MCF-7细胞迁移和侵袭。Western blotting发现G-Rh2呈浓度依赖性下调MCF-7 细胞胞核中ERα表达，上调胞质中ERα的表达，进而上调TNFα的表达，促进细胞凋亡；在动物水平上，建立人乳腺癌MCF-7细胞BALB/c-nu小鼠移植瘤模型，检测到20mg/kg的 G-Rh2治疗乳腺癌移植瘤BALB/c-nu小鼠21 d后与对照组相比，瘤体明显变小，采用HE染色及免疫组化分析其形态学变化。与对照组相比，G-Rh2组肿瘤细胞有明显坏死现象，且细胞核裂解出现凋亡小体。说明人参皂苷Rh2能够阻碍ERα入核，从而上调胞核中TNF-α水平，诱导MCF-7细胞凋亡，抑制移植瘤的生长。该研究为G-Rh2及其衍生物抗肿瘤活性的作用机制提供了很好的实验和理论依据。