金黄色葡萄球菌万古霉素中度耐药机制的研究

Staphylococcus aureus is an important human pathogen that often causes serious clinical infections. In recent years, worldwide emergence and spread of MRSA, VISA, and VRSA strains have posed big challenges to clinical treatment of S. aureus infecton. The reason underlying drug resistance is mainly due to gene mutation, but the interpretation of the molecular mechanism has not been elucidated yet. Recent studies have pointed out that a number of mutations that link drug resistance were found in some VISA strains, such as vraSR, graSR, rpoB, and walK. However, except for the mutations in vraSR and graRS, the role of the mutations found in VISA has not been established. We have obtained a VISA strain by giving vancomycin stress, and genome sequencing indicates that our VISA strain harbors point mutations in three genes, walk, ftsz, and rpoc, respectively. No previous report has linked ftsz and rpoc to VISA. In this proposal, we aim to investigate the influence of ftsz and rpoc on vancomycin susceptibility and elucidate the molecular mechanisms underlying the resistance. This study should not only add the knowledge of the molecular mechanisms of drug resistance, but also provide the new strategy for the clinical treatment of S. aureus infection.

金黄色葡萄球菌（金葡菌）是人类的主要致病菌，可导致严重的临床感染。近年来，世界范围内MRSA、VISA与VRSA的不断出现和传播已成为金葡菌治疗的重大难题。其中金葡菌万古霉素中度耐药（VISA）发生的原因主要是基因突变，但其分子机制的阐释尚未完善。已经报道的与VISA发生相关的基因主要有vraSR，graSR，rpoB和walK,然而这些基因突变并不出现在所有VISA中，说明其它基因位点及其相关分子机制能够导致万古霉素敏感性下降。我们在前期工作中发现,实验室万古霉素压力诱导的VISA中存在三个基因的点突变，分别为walk, ftsz和rpoc,其中ftsz和rpoc与VISA发生的相关性目前尚无报道。本项目拟深入研究ftsz和rpoc对该VISA菌株万古霉素敏感性的影响，并阐释相关的分子机制。该研究将加强对金葡菌耐药机制的认识，进而为金葡菌的临床治疗和检测提供新的理论基础和治疗策略。

本课题研究阐释了金黄色葡萄球菌二元信号系统感应激酶WalK在万古霉素耐药性调控中的功能和分子机制。我们通过抗菌素筛选和全基因组测序，发现万古霉素中度耐受金黄色葡萄球菌（VISA）菌株SV-1发生了walK (G223D)点突变，并详细研究了walK突变导致万古霉素敏感性减弱的分子机制。我们发现walK (G223D)单点突变菌株具有自溶活性减弱、细胞壁增厚以及万古霉素敏感性减弱等表型变化。该点突变导致WalK (G223D)自磷酸化能力减弱，从而降低了转录调控因子WalR的磷酸化水平，低磷酸化水平的WalR结合atlA启动子的能力减弱，从而下调细胞壁代谢相关基因的表达。该研究拓展了对于金黄色葡萄球菌万古霉素耐药性发生的分子机制的认识。另外，在此项目基础上，我们还拓展了研究内容。我们发现辅助性sigma因子SigB的过表达显著提高ccrA的转录水平，并显著增强可移动遗传元件SCCmec的剪切，且SigB直接参与ccrAB启动子区域的识别。我们还发现一段位于ccrAB启动子区域的保守反向重复序列，该序列对ccrAB的表达和SCCmec的剪切具有明显的抑制作用。通过DNA亲和色谱技术发现转录因子SarS能够特异性结合该反向重复序列，进而正向调控ccrAB的表达和SCCmec的剪切。我们还发现SpoVG在MRSA菌株N315中可促进细胞壁合成并抑制细胞壁降解，从而在苯唑西林抗性发生中发挥正调控功能。spoVG敲除菌株对苯唑西林和头孢唑肟的抗性显著性降低，自溶加快，多个与细胞壁合成和降解相关的靶基因转录水平发生改变。我们进一步证明SpoVG蛋白可以直接结合lytN、femA和lytSR的启动子区域。上述研究拓展了对于金黄色葡萄球菌耐药性发生和调控机制的认识，相关结果发表于Antimicrobial Agents and Chemotherapy和International Journal of Medical Microbiology期刊。