杜仲叶诱导骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的物质基础及分子机制研究

多种原因所致的骨缺损和骨坏死（如股骨头坏死等）是临床治疗的一大难题。目前常规的治疗方案（如药物治疗、骨移植及人工骨移植等）效果均不是理想。骨髓间充质干细胞（BMSCs）骨向诱导分化用于治疗此类疾病效果显著。然而，大量研究表明，以往的诱导剂（如化学药物、细胞因子等）存在不足，有的同时还会促进BMSCs向脂肪细胞分化，有的甚至抑制细胞增殖，因而制约了BMSCs在临床上的广泛应用。本课题组经过多年研究发现，以杜仲叶提取物为诱导剂，具有提高骨密度、抑制骨吸收、调节骨代谢的作用，可促进BMSCs增殖和成骨分化，同时还能抑制BMSCs向脂肪细胞分化和上调 Cbfa1mRNA 的表达。本项目拟在前期工作的基础上开展深入研究，采用细胞及分子生物学手段对杜仲叶进行生物导向分离，揭示其活性物质基础，并阐明其作用机制，为BMSCs骨向分化诱导剂的优化及杜仲叶综合开发利用奠定基础。

本课题在前期工作的基础上，对杜仲叶总提取物进行了进一步药效及机制研究,并对杜仲叶进行了系统的化学成分分离，采用细胞及分子生物学手段揭示了其活性物质基础，并阐明了其作用机制。实验结果如下：.杜仲叶总提取物的药理作用：（1）可以防治去势大鼠骨质疏松症，能明显增加其骨密度、骨小梁数量、以及改善骨代谢平衡；（2）能促进SD 大鼠成骨细胞增殖、骨钙素的表达；（3）可以通过提高ERK和AKT磷酸化表达水平，激活Shp2及促进Erk 的活性，促进大鼠成骨细胞的增殖，且成骨细胞增殖率随药物浓度的升高而升高；（4）可以通过激活Shp2 的磷酸化从而促进大鼠大鼠骨质间质干细胞的增殖。.本课题组对杜仲叶进行了系统的化学成分提取分离，从中分离得到85个化合物，鉴定了其中56个化合物的结构，其中包括环烯醚萜类化合物11个、苯丙素类化合物9个、黄酮类化合物8个、木脂素类化合物12个、其它类型化合物16个。.对以上56种化学成分进行了活性筛选和作用机制研究，结果表明：（1）绿原酸可以通过激活Shp2 继而促进Erk 的活性，从而促进大鼠成骨细胞增殖；（2）槲皮素、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷4种成分均可协同经典成骨诱导剂干预细胞，对SD大鼠BMSCs成骨分化具有促进作用，同时槲皮素、芦丁、金丝桃苷在成骨分化过程中对关键转录因子Runx2、Osterix表达在一定范围内具有浓度依赖性；（3）槲皮素还可通过激活ERK 磷酸化，从而促进BMSCs 细胞的增殖；（4）槲皮素、槲皮苷、(+)-丁香脂素、松脂醇二葡萄糖苷4种成分能抑制BMSCs脂向分化，其中槲皮素和(+)-丁香脂素是通过下调PPARγ2、C/EBPαmRNA 的表达、进而达到抑制大鼠BMSCs 成脂分化作用的。.因此认为，杜仲叶中芦丁、金丝桃苷可促进BMSCs成骨分化；(+)-丁香脂素、松脂醇二葡萄糖苷能抑制BMSCs脂向分化；而槲皮素、槲皮苷既可以促进BMSCs成骨分化，又可以抑制BMSCs脂向分化。