PGC-1α基因启动子区非CpG型甲基化在2-型糖尿病胰岛素抵抗形成中作用的研究

In eukaryotes, epigenetic modifications play important roles in regulating gene expression, cell differentiation, morphological development, as well as disease occurrence. Among all types of modifications, DNA methylation at 5-cytosine (5mC) is a wildly-occurred type, which can affect gene expression and alternative splicing patterns by inhibiting the binding of transcription factors within relevant genomic regions. Based on the previous research, the effects of DNA methylations are vary at different regions. However, which sites are critical to regulate the gene expression in promoters? How non-CpG DNA methylation in promoter region regulate the gene expression? In this research, we will choose skeletal muscle cells and mice as targets. By using our site-specific DNA demethylation tools we developed previously, we could edit specific non-CpG DNA methylation sites in promoter region, which may change the expression of gene downstream. The result will reveal the function of non CpG DNA methylation in PGC-1α promotor during the early stage of type 2 Diabetes, enrich our knowledge about epigenetic, and provide potential targets for Diabetes related diseases therapy and technical support.

表观遗传修饰在真核生物基因表达、细胞分化、形态发育和疾病发生等过程中都起到重要作用。5-甲基胞嘧啶(5-mC)作为DNA甲基化的主要形式，通过调控基因表达及选择性剪切等方式参与到上述过程。已有研究显示，DNA上不同位置的甲基化对基因表达的影响不同。那么，对基因表达调控至关重要的启动子，到底哪些位点的甲基化修饰起了决定性的作用呢？启动子区的非CpG型DNA甲基化是如何影响下游基因的表达调控的呢？目前尚不清楚。本项目以骨骼肌细胞及小鼠为对象，借助我们此前成功研发的DNA精准位点去甲基化编辑工具，通过对启动子区非CpG型的DNA甲基化开展编辑并研究由此产生的对下游基因表达的影响，揭示PGC-1α基因启动子区非CpG型甲基化在2-型糖尿病胰岛素抵抗形成中作用，丰富对表观遗传修饰作用的认识，并为糖尿病的治疗提供潜在的靶点和可靠的技术支持。

本研究目的是通过报告质粒和项目负责人此前成功研发的 DNA 精准位点去甲基化基因编辑工具，研究骨骼肌细胞内位于启动子区特定位点的非 CpG 型 DNA 甲基化对下游基因表达调控的影响及其与骨骼肌脂毒性胰岛素抵抗发生的关系，丰富对表观遗传修饰作用的认识，并为 2-型糖尿病的治疗提供潜在的靶点和可靠的技术支持。.在这一方向的探索中，我们成功分析胰岛素抵抗模型目标基因PGC-1α启动子区非CpG类型DNA位点的甲基化修饰情况，结合以往文献和公开数据库，筛选获得6个潜在的关键甲基化位点。之后利用利用荧光素酶报告质粒，我们证明了筛选的6个PGC-1α启动子区非CpG类型DNA位点的甲基化显著抑制下游基因luciferase的表达，抑制作用高达数10倍。为了进一步验证其功能，我们成功筛选6个有效靶向上述目的位点的guide RNA。通过串联guide RNA的方式，成功构建定点编辑上述位点的3个甲基化编辑工具，在CHO-K1细胞内对目标区域进行了定点去甲基化，对下游基因luciferase的表达量恢复至2倍以上。在胰岛素抵抗的生理环境下，利用这些编辑工具对6个靶位点进行了验证，我们也获得了类似的结果。结合以上的实验结果，我们发现PGC-1α启动子区位于中间和末端的非CpG型甲基化位点在胰岛素抵抗的生理环境中起关键作用，降低该位点甲基化水平可有效提高PGC-1α的表达水平，线粒体合成，促进脂代谢。我们用高糖高脂饲料喂养建立肥胖模型，通过对体重，血糖血脂代谢的评估判模型建立成功。然后将肥胖模型老鼠分成对照组和实验组。结合细胞编辑结果，选取位于中间的非CpG型甲基化位点作为编辑对象，构建的合适的针对关键甲基化位点或区域的编辑质粒，原位注射到小鼠小腿腓肠肌。对编辑前后小鼠和正常组小鼠的糖脂代谢、胰岛素耐受及线粒体数量功能进行评估，发现通过编辑质粒的作用明显促进线粒体合成，改善了肥胖小鼠糖脂代谢水平和胰岛素抵抗的现象。.此外，在本研究中，我们也进一步拓展了所开发的精确甲基化编辑工具的应用，通过调整APOBEC-Cas融合蛋白类型，与TET2、T4-BGT结合，开发了全新的基于生物酶法的对模版极低损耗的区域/位点特异性的5mC甲基化定量检测工具，与广泛使用的重亚硫酸盐法相比具有巨大的优势。