木聚糖生物合成中的关键科学问题研究

木聚糖是微管束中次生加厚的主要成分之一，但木聚糖合成的分子机理仍不明确，目前仍然没有相关酶与底物反应的直接证据。本研究从拟南芥中克隆与木聚糖合成相关的多个基因， 利用酵母双杂交、BiFC（分离的YFP）以及免疫共沉淀技术来证明这些蛋白产物间的相互作用；同时在酵母内表达纯化这些蛋白或构建融合表达载体，转化各自的突变体，在恢复功能的突变体中纯化融合蛋白；在此基础上对纯化蛋白进行两两混合或3-4成分混合，然后测定其木糖转移酶活性，并比较主效基因酶复合体和次效基因酶复合体活性间的差异。对参与木聚糖合成的关键基因进行定位及功能比较，明确内质网和高尔基体在木聚糖合成中的作用。制备主要基因蛋白抗体，利用抗体验证基因的定位。对拟南芥中的木聚糖合成的模式推广，分析比较木材的同源基因。本研究将帮助我们进一步明确木聚糖合成及调控的分子机理，为木材的分子改良及调控提供理论和技术基础。

木聚糖在植物次生生长和能量积累方面起重要作用，其合成及利用研究则是近来植物学的热点问题。本项目首先从拟南芥中克隆了木聚糖合成关键酶的多个基因，定位研究表明IRX10、IRX10-L、IRX14、IRX14-L 是高尔基体和内质网共同表达的，FRA8 和F8H 只在高尔基体表达，而IRX9 和IRX9-L主要在内质网表达。利用BiFC以及免疫共沉淀技术来证明了这些蛋白产物间的相互作用，并且蛋白可以形成同源或异源二聚糖，再形成高聚体；GT47家族中的IRX10和FRA8结构差异在于IRX10的N端是信号肽，而FRA8蛋白是跨膜区，且Western杂交证明了IRX10的N端信号肽可以切除。对IRX10和FRA8蛋白中的保守extosin 功能域进行交换，新蛋白能互补各自的突变体，因而从进化的角度上，功能域在功能上还是保守的。接着，我们建立了一种准确快速测定木糖转移酶活性的方法，利用从植物中提取的微囊体蛋白以尿苷二磷酸木糖（UDP-Xyl）和含荧光基团的低聚木糖（Xyln-AA）为底物进行加成反应，高效液相色谱（HPLC）检测产物，结果表明XylT可以将多至5个UDP-Xyl转移到受体上，上部微囊体XylT活性最小而下部最大，XylT活性随底物聚合度增大而增强。酶切结果证明了加成产物可以被木聚糖酶酶切，核磁分析产物间分子量大小差异刚好是32，符合木糖失去一个水的分子量，充分证明了产物是木聚糖加成反应的产物。进一步，还原胶实验表明IRX9、IRX10和IRX14的抗体均会产生一条分子量约在480KD的条带，说明它们可能形成分子量相同复合体。激光共聚焦实验表明：IRX9单独表达时，IRX9更倾向于内质网表达，IRX9与IRX14共表达时也是如此，只有当IRX9与IRX10和IRX14共表达时，更倾向于高尔基体表达。体外过表达酶活性测定表明，IRX10单独表达有低酶活性，而当IRX9与IRX14单独表达时没有活性，IRX9和IRX14共表达时也没有活性，IRX10与IRX9及IRX10与IRX14两两共表达时有少量活性，而只有当IRX10与IRX9、IRX14三者共表达时才有高酶活性，进一步证明了三者之间可以形成复合体。此外，我们还对木聚糖合成酶调控及底物进行了研究。本项目目前已经发表三篇SCI文章、两篇核心文章，申请了三个专利，其中一项已经授权，目前还有多篇SCI论文在投稿。