紫茎泽兰苯丙氨酸解氨酶基因对羟基泽兰酮分泌的调控机理

紫茎泽兰（Eupatorium adenophorum）是我国最为严重的恶性外来入侵杂草之一，紫茎泽兰能够分泌化感物质羟基泽兰酮是其入侵的重要原因。在基金项目（30771422）的资助下，申请人的研究表明酚类物质代谢途径中关键酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）与羟基泽兰酮（HHO）高度相关。为此本项目从苯丙氨酸解氨酶入手，克隆PAL基因的其它家族成员并进行表达谱分析；对紫茎泽兰PAL基因进行过量表达和RNAi干涉的遗传转化，获得转PAL基因的紫茎泽兰转基因植株；定量PCR对野生型和转基因植株的PAL基因的表达和受HHO诱导条件下差异分析，对野生型和转基因植株的HHO分离纯化，分析差异。不同条件下PAL基因和酚类代谢途径的其他关键酶表达之间的关系。探讨PAL基因与化感物质羟基泽兰酮关系，研究该基因与其它代谢过程中关键酶的关系，为揭示紫茎泽兰化感的作用机理提供理论基础。

紫茎泽兰是一种世界入侵性恶性有毒杂草，具有生命力强，传播速度快，植株本身能分泌有害的化感物质等特点，已经对入侵地的农、林、畜牧业生产造成了严重的经济损失，并因其竞争排挤本地植物并很快形成单种优势群落而造成了生态灾难。是我国面临的重大生态灾害物种之一。紫茎泽兰羟基泽兰酮（HHO）作为一种倍半萜类化合物，已经被证明是一个对受体植物的生长发育产生显著影响的化感物质。本研究在已有工作的基础上对紫茎泽兰次生代谢相关基因以及苯丙氨酸解氨酶基因对羟基泽兰酮分泌的调控机理开展了一系列研究工作。取得主要的进展如下：1. 在已经构建的紫茎泽兰cDNA文库基础上，并从该文库中筛选克隆到了苯丙氨酸解氨酶，肉桂酸4-羟化酶核心序列，利用荧光定量PCR研究其在羟基泽兰酮处理下的表达模式变化，结果显示羟基泽兰酮处理紫茎泽兰后表达量变化显著，这两个基因可能与羟基泽兰酮代谢密切相关。2. 从拟南芥中克隆到了对香酰连接酶，咖啡酸5-羟基阿魏酸O-甲基转移酶（COMT）核心序列，利用半定量PCR研究其在羟基泽兰酮处理下的表达模式变化，发现羟基泽兰酮处理拟南芥后两个基因在拟南芥中表达量变化显著，提示这两个基因可能参与拟南芥中羟基泽兰酮类似物的代谢。3. 在所克隆的四个基因中，苯丙氨酸解氨酶的表达量变化最为显著，在高低浓度羟基泽兰酮处理后该基因的表达量均显著上调。利用Southern杂交检测了PAL基因在紫茎泽兰中的拷贝数，发现了PAL多基因家族，并推测PAL基因家族有3个以上的成员。4. 利用RACE技术获得了紫茎泽兰中EaPAL1、EaPAL2的全长序列信息，并利用荧光定量PCR研究其在羟基泽兰酮处理下的表达模式变化，发现EaPAL2 对羟基泽兰酮处理的响应更为明显。说明EaPAL2 可能更直接的参与了羟基泽兰酮的代谢。5. 构建了苯丙氨酸解氨酶的过量表达载体和RNA干涉载体，进行了烟草和紫茎泽兰的遗传转化。6. 研究了苯丙氨酸解氨酶与代谢通路中其他基因的相关性，证实该基因与肉桂酸等酚酸类物质密切相关。本研究共发表SCI论文5片，国内核心2篇。