脂筏介导的铁转运体膜融合/外排及其对铁环境的响应

水稻可食用籽粒铁营养富集一直是品质改良的育种目标之一。水稻籽粒铁含量很低但植株含铁充足，说明籽粒铁富集有改善的空间。目前铁转运研究热点已从高效吸收转移到膜泡参与的有效分配。本室已获得的MxIRT1和OsYSL1转基因水稻,可提高籽粒铁含量，且与膜泡运输有关,然而相关分子机理不清。通过基因芯片已发现,缺铁诱导了包括脂筏在内的一批转录本上调，而膜融合的SNC1/2和小G蛋白YPT1下调,推测MxIRT1膜泡与质膜融合是细胞响应环境铁的节点。本课题将解析缺铁时大量MxIRT1膜泡不均匀聚集在胞质中,加铁后整合到质膜上的分子机制;拟通过三方面实现:1)分离铁转运体、脂筏与膜融合蛋白的共沉淀复合物 2)利用不同表达系统研究铁诱导的铁转运体膜泡、脂筏与融合蛋白的共定位关系3)利用脂筏和膜融合突变体、抑制剂等,测定活体铁的流向与富集,鉴定响应铁信号的关键因子。为水稻籽粒铁富集,提供可借鉴的理论基础。

缺铁性贫血仍然是困扰人类健康的隐性杀手。药补不如食补，在以稻米为主食的中国，水稻可食用籽粒铁营养富集一直是品质改良的育种目标之一。水稻籽粒铁含量很低(4.6-27.3mg/kg),但稻壳/糠的含铁充足(86-430mg/kg)，说明籽粒铁富集有改善的空间。目前铁转运研究热点已从高效吸收转移到膜泡参与的有效分配。本课题获得的MxIRT1、OsYSL1、OsSec24、OsDRP和OsCSN6等转基因水稻；转MxIRT1的水稻可提高籽粒铁含量；发表SCI论文四篇；申请专利四项；另在细胞水平获得四方面成果:1）利用激光共聚焦显微镜，用脂筏和细胞膜融合相关的多种突变体，研究了MXIRT-GFP膜泡响应铁信号的动态变化。即缺铁诱导后GFP标记的铁转运体以膜泡形式分布在胞质中，加铁后膜泡与质膜的flipin特异标记的脂筏结构域共定位。而转基因突变体无此现象。2）利用脂筏的抗去污剂tritonX-100特性和密度梯度离心分离脂筏微结构域，western确定加铁后铁转运体的蛋白条带存在于脂筏中。对脂筏的western杂交条带进行质谱分析，确定MXIRT-GFP和胆固醇、鞘磷脂、膜融合有相关性。3）构筑了响应铁浓度变化的模式酵母细胞，除观察缺铁、加铁的响应外，还研究了过铁内、外源铁转运体的不同降解途径：内源FET4通过泛素介导的内吞途径，而外源MxIRT1通过泛素介导的自嗜途径，最后都进入液泡降解。4）本课题还对于芯片筛选的缺铁相关基因做了深入的转基因水稻表型观察、Real-Time PCR、western、IP等工作。如a）在水稻中发现了响应缺铁信号的新膜泡相关蛋白OsSEC24P（2010发表），证明它是一种新的包裹PM-ATPase1的COPII的衣被蛋白；b）确定了“MxIRT1膜泡与质膜融合是细胞响应环境铁的节点(2012)；c）使水稻在缺铁条件下，通过调控细胞分裂而造成侏儒幼苗的新转录因子DRP（2012）；d）蛋白酶体的CSN6通过调控cullin的Dennedilation化，而调节水稻的转录因子IDEF1，进而影响其他铁相关的基因（拟投稿于Plant Journal）。总之确定了MxIRT1膜泡与质膜融合是细胞响应环境铁的节点；解析了有铁时MxIRT1膜泡经过膜融合，将其外排到质膜上是脂筏介导的；而过铁MxIRT1通过泛素介导的自嗜作用降解，以便维持细胞中铁的平衡。