巴西橡胶树乳管伤口堵塞物形成调节的研究

巴西橡胶树是天然橡胶的主要来源。在割胶切断的乳管伤口末端堵塞物的形成是限制天然橡胶产量的关键因子之一。目前，对这种堵塞物的成分一直没有定论，对堵塞物形成的调节知之甚少。最近，我们发现乳管伤口堵塞物由主要来自黄色体内含物蛋白形成的"蛋白质网"、聚集的橡胶粒子以及黄色体膜碎片组成，在乳管伤口末端有actin（细胞骨架之一）积累。据此，我们认为橡胶粒子和黄色体膜碎片结合在"蛋白质网"上形成堵塞物，并通过"蛋白质网"锚定在细胞骨架上，pH值对堵塞物的形成有重要调节作用。这是一种关于乳管伤口堵塞机制的全新学术思想。本项目拟采用细胞生物学、生理生化和蛋白质组学的有关技术，研究乳管伤口"蛋白质网"与actin之间、"蛋白质网"与黄色体膜碎片和橡胶粒子之间的相互作用，并分析影响乳管伤口堵塞物形成的相关因子，阐明乳管伤口堵塞物形成调节的机制，为发展更合理的采胶技术和开发更安全有效的产量调节剂提供直接依据。

巴西橡胶树乳管伤口末端堵塞物的形成是限制天然橡胶产量的关键因子之一。目前，对这种堵塞物的成分尚无定论，对堵塞物的形成调节更是知之甚少。最近我们发现乳管伤口堵塞物主要由来自黄色体的“蛋白质网”、聚集的橡胶粒子以及黄色体膜碎片组成，乳管伤口末端有肌动蛋白（actin）积累。以此为基础，采用细胞生物学、生理生化和蛋白质组学相关技术，对乳管伤口“蛋白质网”与actin之间、黄色体膜碎片和橡胶粒子之间的相互作用进行了研究，并分析了影响乳管伤口堵塞物形成的相关因子，取得如下研究结果：.1、成功构建橡胶树actin基因的原核表达载体并转化入菌株E.coil BL21(DE3)中，实现了该蛋白的高效表达、纯化并制备了兔多克隆抗体。采用pull-down发现actin与蛋白质网的主要成分之一的glucanase有明显的结合作用，首次证明乳管伤口堵塞物可以通过“蛋白质网”锚定到actin等细胞骨架上；.2、外施actin的解聚因子能明显增加CATAS 7-33-97萌条排胶的干胶含量以及大树的排胶时间，可见actin解聚有利于排胶，不利于堵塞物的形成；.3、利用蔗糖密度梯度离心法成功分离黄色体，并纯化大量的glucanase。提取含活性的黄色体膜蛋白，采用Co-IP技术成功捕获了几个与glucanase互作的黄色体膜蛋白并初步鉴定。.4、反应体系的pH值对“蛋白质网”的体外形成具有明显的影响。在酸性条件下“蛋白质网”体外形成较少，随着pH值的升高其形成逐渐增强。在接近胶乳天然pH值条件下，H2O2对“蛋白质网”的形成有促进作用，而R-SH对“蛋白质网”体外的形成有抑制作用。pH值、H2O2、R-SH对“蛋白质网”与黄色体膜碎片、actin的互作的影响与其对“蛋白质网”体外形成的影响基本一致。H2O2对“蛋白质网”与橡胶粒子的互作起到较明显的促进作用；.5、对排胶过程中胶乳的H2O2含量、R-SH含量、pH值以及其它生理参数进行分析，发现硫醇含量高低是橡胶树无性系的特征，与排胶时间长短显著正相关，可见R-SH是堵塞物形成的抑制因子。.这些结果较好的阐述了乳管伤口堵塞物形成调节的机制，并为发展新型的产量调节剂奠定了坚实的基础。