蛇毒纤溶因子FⅡ通过溶解血栓以及激活蛋白C途径的抗弥漫性血管内凝血的机制研究

抗弥漫性血管内凝血（DIC）研究是当前心血管药理研究的重大课题，消除组织器官中的微血栓和抑制血液的高凝状态是治疗DIC的关键。申请者发现蛇毒纤溶因子FⅡ具有抗DIC的作用，进一步研究发现，FⅡ溶解微血栓以及激活血浆蛋白C与其抗DIC作用密切相关。本项目拟通过建立LPS诱导的DIC动物模型，应用组织学，生理生化学，发色底物法以及血流动力学等方法观察FⅡ溶解微血栓，改善微循环，改善凝血、纤溶系统，保护器官功能的作用，证明FⅡ具有良好地抗DIC的作用；然后进一步从整体动物水平和细胞水平，应用放射法，ELISA法，发色底物法，western blot，confocal和RT-PCR等技术，深入探讨FⅡ溶解血栓和激活蛋白C的机制及调控途径。本项目通过上述实验，明确蛇毒纤溶因子FⅡ高效地抗DIC的作用，并阐明其通过溶解血栓和激活蛋白C途径的抗DIC机理，为DIC的治疗提供新的理论依据和新的药物。

弥散性血管内凝血(DIC)是一类由多种病因引起的、以小血管内广泛微血栓形成及继发性出血为特征的临床综合征。因而抗DIC研究是当前心血管药理研究的重大课题。消除组织器官中的微血栓和抑制血液的高凝状态是治疗DIC的关键。但目前抗DIC的溶栓和抗凝药物的疗效均不可靠，因而寻找新的溶栓性强，又有抗凝作用的抗DIC药物具有较大的临床价值。本课题组研究的蛇毒纤溶因子FⅡ在多种血栓模型中能直接溶解血栓，还具有一定的抗凝作用以及前期研究中发现，蛇毒纤溶因子FⅡ可降低DIC动物的死亡率，改善DIC实验动物凝血、纤溶系统，提示FⅡ具有一定的抗DIC的效应。. 因而本项目通过分离纯化具有高效溶栓效应的蛇毒纤溶因子FⅡ，以满足后续实验研究需要，并建立脂多糖（LPS）诱导的DIC动物模型，应用发色底物法、动态图像技术、血生化检查、组织病理检查等方法，探讨其抗DIC的效应，研究发现FⅡ能显著溶解组织器官的微血栓，改善微循环，改善凝血、纤溶系统，保护肝肾器官功能，降低动物24h死亡率，证明蛇毒纤溶因子FⅡ在整体动物水平具有良好地抗DIC的作用。.然后进一步从整体动物水平和细胞水平，应用放射法，ELISA法，发色底物法，western blot和RT-PCR，cofocal等技术，阐明蛇毒纤溶因子FⅡ通过溶解血栓和激活蛋白C途径的抗DIC机理，研究发现FⅡ的溶栓活性与其抗DIC的效应成正相关，可直接溶栓，亦可激活t-PA, u-PA和抑制PAI-1，从而间接激活纤溶系统；同时，FⅡ在体内外均可以激活蛋白C，但对血栓调节蛋白(TM)和内皮细胞蛋白C受体(EPCR)均无作用，提示FⅡ的抗凝作用依赖于蛋白C的激活。. 在进一步的研究中，我们还发现，蛇毒纤溶因子FⅡ可显著抑制兔LPS诱导的兔败血症动物模型的作用的炎症因子释放，同时激光共聚焦的结果亦显示五步蛇毒纤溶酶在体外降低炎症因子（TNF-α）的水平，提示五步蛇毒纤溶酶对炎症因子有显著的拮抗作用。同时，我们还发现，蛇毒纤溶因子FⅡ还能抑制NF-κB P65的蛋白，NF-κB mRNA的表达，以及促进IκKα蛋白生成，提示蛇毒纤溶因子FⅡ是通过NF-κB 信号转导通路拮抗炎症因子的释放，以上研究结果为DIC的治疗提供新的理论依据和新的药物。