PKA和PKC信号通路异常介导的NHE3功能失调在胆囊结石形成中的机制研究

Enhanced absorptive function of the gallbladder is a major cause of gallstone disease, but the pathogenic mechanisms are not clear. Our preliminary data showed that NHE3 activity and cholesterol content of the plasma membrane were up-regulated in the process of gallstone formation. We propose that activation of PKC and inhibition of PKA by cholesterol synergistically stimulates NHE3 activity by enhancing its apical membrane localization. By using modern cellular and molecular techniques, including but not limited to confocal immunofluorescence, co-immunoprecipitation and native-PAGE electrophoresis, we will test whether cholesterol alters PKA and PKC signaling, whether attenuation of PKA activity down-regulates the phosphorylation and internalization of NHE3, and whether PKC promotes NHE3 exocytosis from the intracellular pool through enhanced phosphorylation of ezrin. The proposed study will shed novel light on the underlying mechanisms of NHE3 regulation by high cholesterol content, thereby to provide novel strategies in the prevention and treatment of gallstones.

胆囊吸收功能增强是胆囊结石形成的重要原因之一，但其发生机制不清。我们在前期研究工作中发现结石形成过程中胆囊粘膜胆固醇含量增高和NHE3活性增强，由此我们推测，高胆固醇可能通过抑制PKA功能和激活PKC活性，以协同作用的方式调控NHE3在胆囊粘膜上皮细胞中的定位，提高NHE3在顶质膜的表达水平，进而增强其转运活性和促进胆囊吸收。本课题主要拟采用免疫荧光共聚焦技术、免疫共沉淀和非变性胶电泳分析等技术手段研究胆囊结石形成过程中是否出现了PKA和PKC信号通路调控的改变；明确PKA是否抑制NHE3的磷酸化进而抑制其从细胞膜到细胞质的转运，PKC是否活化ezrin进而促进NHE3从细胞质到细胞膜的转运。该研究将明确PKA和PKC信号通路异常上调NHE3活性的机制，为胆囊结石的预防与治疗提供新靶点。

项目背景：钠氢交换蛋白3（NHE3）功能失调导致的胆囊浓缩增强，胆汁中胆固醇、钙离子及粘蛋白等促成石成份浓度增高是结石形成的重要诱因，但具体机制不清。我们在以往研究基础上提出致石饮食导致的PKA和PKC信号通路活性改变以及NHE3功能异常是胆囊浓缩增强的重要诱因。.主要研究内容：课题组以高胆固醇饮食构建C57BL/6小鼠胆囊胆固醇结石模型。采用RT-PCR检测正常饮食组以及致石组胆囊粘膜NHE3在mRNA水平表达的差异；采用Western blot检测两组胆囊粘膜NHE3、PKCα、NHERF1以及ezrin蛋白的表达情况；采用免疫荧光检测胆囊组织中NHE3的表达；采用免疫共沉淀检测NHE3与ezrin以及NHERF1的相互作用情况。此外，我们以鹅脱氧胆酸（CDCA）刺激胆管癌细胞，采用Western blot检测CDCA对NHE3、PKCα、NHERF1以及ezrin蛋白的表达影响；采用免疫共沉淀检测CDCA对NHE3与ezrin相互作用的影响。.结果：结石组小鼠胆囊粘膜NHE3蛋白的磷酸化水平（p-Ser552-NHE3）明显增高，与胆囊粘膜浓缩功能异常的现象吻合。并且，我们在免疫荧光染色实验中发现 NHE3 同时表达于上皮细胞顶质膜与胞浆内。此外，我们还发现结石组小鼠胆囊组织中PKCα和NHERF1表达增高，ezrin的磷酸化水平增高。免疫共沉淀实验显示NHE3能够与NHERF1以及ezrin结合并形成蛋白复合体。这些研究结果提示，在胆囊粘膜上皮细胞内，NHE3蛋白复合体构成的改变是调控其离子转运活性的一个机制。在PKA激动剂forskolin的协同作用下，CDCA可以明显增强胆管癌细胞中NHE3活性抑制因子PKCα的表达，并活化细胞骨架连接蛋白ezrin。同时，CDCA能够促进ezrin与NHE3形成蛋白复合体。.结论及科学意义：胆囊结石形成过程中胆囊粘膜浓缩功能异常是多条信号通路及调控因子表达异常的结果；生理状态下CDCA很可能对胆囊上皮细胞NHE3的活性具有抑制作用；致石胆汁中CDCA浓度减低可能是结石形成前期胆囊浓缩功能增强的重要诱因。通过本项目的系统研究，能够加深对胆囊结石发病机理的理解，为预防和治疗胆囊胆固醇结石提供理论依据和实验基础。