载胶质细胞源性神经营养因子基因的壳聚糖复合骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤

分离、培养高纯度的大鼠MSCs，流式细胞仪进行细胞特征鉴定。将其与GDNF共同培养，诱导分化成神经细胞。采用基因重组方法构建GDNF-DNA质粒，通过DNA测序确定重组菌株基因序列，确认GDNF的cDNA片段成功插入。通过复凝聚法制备载GDNF基因的壳聚糖纳米粒子，检测蛋白质的表达。将大鼠MSCs与载GDNF基因的壳聚糖纳米粒子共同培养，其诱导分化的神经细胞通过神经元特异性核蛋白（NeuN）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、神经丝蛋白（NF）等进行鉴定。使用脊髓打击损伤模型，采用两种注射方法将载GDNF基因的壳聚糖纳米粒子与大鼠MSCs复合物注入，一种多点直接注入脊髓损伤部位，一种由大鼠尾静脉注入，观察大鼠肢体功能恢复情况、电生理变化及组织学上移植细胞生长、增殖、迁移情况及神经再生情况等，观察治疗效果，并比较两种注入方法优劣。

脊髓损伤的修复仍然是一个世界性难题，近年来，干细胞治疗脊髓损伤逐渐成为研究热点，胶质细胞源性神经营养因子作为新近发现的一种神经营养因子，已有研究表明其对多种神经元可发挥营养作用，另外，壳聚糖因其独特的生物学特性有望成为良好的脊髓组织工程支架材料。. 我们通过全骨髓贴壁法成功实现了对大鼠MSCs的分离、培养、纯化、鉴定以及大鼠GDNF基因的抽提、GDNF-DNA质粒的构建，采用PCR等技术证实了目的基因的表达；同时完成了载GDNF基因壳聚糖纳米粒子的制备，并成功构建了可注射性季铵盐壳聚糖三维细胞支架，以便于注射治疗。进一步研究证实大鼠MSCs可在外源性GDNF作用下向神经样细胞分化，而载GDNF基因重组质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后可以持续分泌GDNF、持续诱导MSCs分化成神经元样细胞，并进行了鉴定。进一步拓展研究了载GDNF基因重组腺病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化成神经元样细胞及其鉴定，并对两者的分化情况进行了初步比较。在此基础上，我们成功将载GDNF基因的壳聚糖与MSCs复合，并将其于脊髓损伤部位多点直接注射治疗大鼠脊髓损伤，并与尾静脉注入方法相比较。结果表明：载GDNF基因的壳聚糖复合MSCs对大鼠脊髓损伤有良好修复作用，可提高其BBB评分、提高肢体MEP的波幅、缩短其潜伏期、改善其病理损伤情况，MAP-2、GFAP等免疫组化图像分析也支持此结果。而腺病毒转染与质粒转染两种转染方法在大鼠脊髓损伤治疗方面未显示出统计学差异。研究也显示直接注射方法更有利于脊髓损伤大鼠后肢运动功能的恢复，对脊髓损伤治疗效果优于尾静脉注射法。. 综上所述，本研究结果为干细胞治疗脊髓损伤提供了一种新的方法。.　　课题负责人严格执行定期汇报制度，按规定定期上交研究进度进展报告，并在项目实施后通过了中期评估检查。本项目共培养硕士研究生6名。课题项目成果以系列论著的形式在《Cytotechnology》、《Brain research》、《中国矫形外科》、《中国组织工程研究与临床康复》、《中国组织工程研究》、《中国实验诊断学》、《国际骨与关节杂志》等国内外专业杂志上发表，其中，已发表SCI论文1篇，已修回SCI论文1篇，国内核心期刊已发表7篇，已录用待发表1篇，另有数篇论文处于投稿、审稿阶段。