古老岩盐沉积中的噬菌体多样性及其基因组和宿主域研究

Our previously research suggested that not only prokaryotes but also pahges are abundant in ancient salt deposits. To estimate phage diversity, genome sequences and host range in ancient salt deposits, many methods are carried out. Phages abundances in different Yipinglang salt mine samples are estimated by direct counting of virus-like particles under epifluorescence microscopy. Phage diversity is determined based on morphological data gathered using transmission electron microscopy (TEM). Phage abundance and diversity were compared across samples in order to determine how these data correlate with environmental abiotic factors. This study optimize methods to isolate phage in hypersaline soils, and phage isolates genomic nucleic acid were extracted and sequencing partially, morphology was determined by TEM. One phage genomic sequences is determined and analyzed. The result will indicate the common and different characteristic among haloviruses genome sequences. Meanwhile, phage isolates host range was assessed by using bacteria, archaea and eukaryotic cells. This work will make further efforts to expend and enrich context of study in halophiles, collect a batch of salt mine phages and their host strains, also, contribute to reveal law of viral evolution, the maintenance mechanism of microbial diversity, the mechanism of gene transfer among species and its relationship with evolution.

我们的前期研究工作表明，古老岩盐沉积中不仅具有较为丰富的原核生物多样性，而且也分离到2株噬菌体。为了了解古老岩盐沉积中噬菌体多样性及其基因组和宿主域特征，本项目拟采集一平浪盐矿矿道土壤等样品，通过电镜、荧光显微镜观察、纯培养分离（优化此前分离方法）和鉴定，研究古老岩盐沉积中噬菌体类群及分布规律，评价这一高盐环境中噬菌体多样性及其与环境非生物因子的相关性；测定1株代表性噬菌体的全基因组序列，分析其基本特征，与其它噬菌体基因组比较，揭示古老岩盐沉积中噬菌体的个性与共性；进行以细菌、古菌和真核生物细胞为对象的跨域侵染实验，评价噬菌体的宿主域。本项目的实施将进一步拓展和丰富我国嗜盐微生物的研究内容，获得一批高盐噬菌体及其宿主菌株资源，为揭示古老岩盐沉积高盐环境中噬菌体的演化规律，阐明微生物多样性的维持机制，物种间基因转移机制及其与生命演化的关系提供有学术价值的科学证据。

高盐环境是巨大的微生物资源宝库，其中的病毒资源亟待研究和开发。目前全世界分离到的原核生物病毒约6300株，其中感染嗜盐细菌的病毒不足10株。本项目对云南5个盐矿中的病毒进行了电镜观察和分离。电镜观察表明盐矿中的病毒主要为头尾型、丝状和球状。头尾型病毒分布广泛，数量丰富，头部直径53-58 nm，尾长50-212 nm。丝状病毒形态多样，长短不一，直径5-12 nm。球状病毒有的具有囊膜，直径20-110 nm。对5个盐矿的15个卤水或土壤样品进行病毒分离，共获得9株裂解性噬菌体和1株溶原性噬菌体。我们研究了其中4株噬菌体的部分生物学特性。4株噬菌体中2株感染盐单胞菌，2株感染色盐杆菌，将它们分别命名为QHHSV-1、YPHSV-1、YPCPV-1和YPCPV-2。QHHSV-1和YPHSV-1均为长尾型病毒，YPCPV-1和YPCPV-2电镜形态与HHPV-1 等多态形病毒相似。QHHSV-1，YPHSV-1， YPCPV-1和YPCPV-2的最适感染盐浓度分别为5，3-8，8和8%（NaCl, w/v%）。QHHSV-1是目前已知的第一株感染Halomonas ventosae的噬菌体，为裂解性，头部直径47 nm，尾长75 nm，属长尾噬菌体科。其宿主域较窄，不能感染受试的其他Halomonas spp.，酵母和古菌。QHHSV-1对温度具有较好的耐受性，对碱性pH的耐受性好于酸性，对盐环境也有较好的耐受性。QHHSV-1对氯仿和Triton X-100不敏感，但对SDS和蛋白酶K敏感。钙离子的加入抑制了QHHSV-1对宿主的吸附。一步生长曲线表明QHHSV-1的潜伏时间为30 min，爆发量为73 PFU/细胞。SDS-PAGE显示QHHSV-1含有4个主要蛋白(48, 42, 34和17 kDa)。基因组测序及分析显示，QHHSV-1基因组为双链DNA，全长37270 bp，G-C含量66.8%。QHHSV-1基因组不含非编码RNA，含有1个1631 bp的重复序列。预测含有72个ORF，其中42个可以在不同数据库中获得注释。6个ORF与KEGG中的代谢通路有关，其中2个ORF与半胱氨酸和蛋氨酸代谢有关。32个ORF在nr库中得到注释，分别与感染肠杆菌、假单胞菌、伯克氏菌等的噬菌体相关。系统发育分析显示QHHSV-1与绿色杜氏盐藻病毒SI2亲缘关系较近。