ERβ通过调控FOXO3a介导的自噬诱导卵巢早衰的机制研究

Autophagic death of granulosa cells will lead to follicular atresia, which further causes decreasing ovarian reserve (DOR) and premature ovarian failure (POF). Forkhead box O3 (FOXO3a) is considered to be the key factor regulating autophagy. Our previous data showed that the expression of ERβ, FOXO3a and autophagy associated genes were increased in the granulosa cells of the patients of DOR. Meanwhile, transfection with siERβ decreased the levels of the FOXO3a and autophagy associated genes, but the specific mechanism of ERβregulation of autophagy remains poorly understood. Therefore, we will inhibit or activate ERβ in granulosa cells, and underlying mechanism of ERβ governing FOXO3a gene expression at both transcriptional and post-transcriptional levels. Then gene knockdown and overexpression were employed to determine the involvement of ERβ during autophagy via FOXO3a. Further, we will use selective autophagy inducers and inhibitors to investigate whether ERβ leads to the apoptosis of granulosa cells by inducing autophagy. Finally, DOR mouse model was constructed to demonstrate the regulation of ERβ on ovarian reserve function and the involvement of ERβ inhibitor in the protection of ovarian reserve function. Proving this hypothesis will elucidate the mechanism of high expression of ERβin DOR from the perspective of autophagy, and provide a better understanding of ERβ as the molecular marker and therapeutic target of DOR.

颗粒细胞自噬性死亡使卵泡闭锁，导致卵巢储备功能下降（DOR），进而发展为卵巢早衰。叉头框蛋白FOXO3a是调控自噬的关键因子，前期我们发现ERβ、FOXO3a及自噬相关基因在DOR患者颗粒细胞中表达增加，敲低ERβ后颗粒细胞中FOXO3a以及自噬相关基因的表达随之下降，但其调控自噬的机制不明。因此，我们将在颗粒细胞中用siRNA敲除和过表达ERβ后，利用染色质免疫共沉淀（CHIP）和荧光素酶实验等确定ERβ与FOXO3a基因的结合力，验证其在转录水平和转录后修饰水平对FOXO3a表达的调控，及FOXO3a介导的ERβ对自噬的调控作用；通过自噬诱导剂和抑制剂明确ERβ通过诱导自噬来调控颗粒细胞死亡；构建DOR小鼠模型，论证ERβ对卵巢储备功能的调控及其抑制剂在保护卵巢功能中的作用机制。最终明确ERβ—FOXO3a—颗粒细胞自噬性死亡—卵巢储备功能下降的机制，为其成为DOR的治疗靶点提供证据。

卵巢储备功能低下（diminished ovarian reserve，DOR）是指卵巢内卵母细胞数量减少和质量下降。卵巢颗粒细胞（granulosa cells，GCs）的自噬性死亡可能是导致DOR的关键因素之一。我们对DOR患者GCs自噬的水平及调控机制进行探讨，为寻找DOR的分子标志物和治疗靶点提供数据支持。. 我们研究发现DOR患者GCs中雌激素受体β（Estrogen receptor β，ERβ）、叉头框O转录因子3a（forkhead box O transcription factor 3a，FOXO3a）、自噬相关因子表达及自噬小体数量较对照组升高。ERβ可结合在FOXO3a启动子区的ERE序列上，转录激活FOXO3a表达。ERβ可通过FOXO3a调控GCs自噬，进而影响细胞的增殖与凋亡能力。随后，我们通过注射环磷酰胺（cyclophosphamide，Cy）的方式构建了DOR小鼠模型，在DOR小鼠模型中同样发现了ERβ、Foxo3a及自噬水平升高，卵巢内凋亡卵泡数增多。对DOR小鼠给予ERβ抑制剂PHTPP治疗后发现DOR小鼠卵巢中FOXO3a及自噬相关因子表达下降，小鼠卵巢凋亡卵泡数减少。此外，PHTPP治疗后，DOR小鼠血清AMH水平升高、原始卵泡数增多、MII卵获得率提高, MII卵ROS水平与纺锤体异常比例下降；2-细胞胚胎形成率及囊胚形成率提高，自然合笼窝产仔数增多，提示PHTPP可部分改善Cy诱导的DOR小鼠的卵巢储备功能，胚胎发育及活产数。以上研究为ERβ成为DOR的可能的分子标志物以及分子治疗靶点提供实验依据。. 我们通过logistic分析构建预测模型，发现基础E2>60 pg/mL是卵巢低反应（poor ovarian response，POR）临床妊娠失败独立危险因素之一，以上结果发表于Front Endocrinol (Lausanne). 2021; 12: 717288。