肝癌微环境MDSC来源外泌体中miR-4295促循环肿瘤细胞释放的作用及其检测的预后评估价值研究

The releasing of circulating tumor cell (CTC) represents the key process of the metastasis and recurrence of hepatocellular carcinoma (HCC), in which the tumor microenvironment plays a vital role. Our previous work has verified the numerical relationship between in-situ myeloid-derived suppressor cells (MDSC) and CTCs. MDSCs-derived exosomes carry abundance miR-4295 and promote the invasion of HCC with the cooperation of its targeted gene, ARHGAP24. Furthermore, we have revealed the potential utility of plasma exosomal miR-4295 in clinical practices. Based on these previous findings, we aimed to systematically investigate the role of miR-4295/ARHGAP24 axis in promoting CTCs releasing as well as in modulating the tumor characteristics and to clarify the detailed functions through flow cytometry assay for CTCs in vivo, tumor cellular functional assays together with clinical cohort analysis. The application of plasma exosomal miR-4295 as a novel HCC biomarker and the effects in inhibiting CTC releasing and metastasis of HCC by targeting MDSCs-derived exosome will be further evaluated. Our investigation would provide new insights into the prevention of HCC metastasis and recurrence.

循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）释放是肝癌转移复发的关键步骤，肿瘤微环境在此过程中扮演重要角色。我们经前期工作发现肝癌微环境中骨髓来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）的含量与外周CTC水平呈正相关；MDSC来源外泌体中miR-4295含量升高，并通过调控其潜在靶标ARHGAP24促进CTC的释放。此外，我们还发现血浆外泌体miR-4295检测在肝癌中具有潜在的临床价值。本研究拟在此基础上运用“活体流式”CTC检测技术、体内外肿瘤细胞功能实验联合临床队列研究，阐明miR-4295/ARHGAP24轴影响CTC释放及肝癌肿瘤生物学效应的具体作用，通过临床队列评估血浆外泌体miR-4295作为肝癌预后标志物的应用价值，探索通过外泌体抑制CTC释放及肿瘤转移的效果，为肝癌转移复发的防治提供新思路和转化依据。

循环肿瘤细胞（CTC）释放被认为是肝癌转移复发的重要过程。项目组前期工作研究发现肝癌微环境中骨髓来源抑制性细胞（MDSC）外泌体中miR-4295表达增多，可能通过调控ARHGAP24表达参与CTC释放。本课题在国家自然科学基金项目的资助下，成功构建了基于ARHGAP24表达的肝肿瘤原位模型，通过体内实验证明ARHGAP24抑制肝癌增殖及转移。进一步通过瘤内注射脂质体包裹反义miRNA-4295，监测小鼠在不同时间点下体内CTC释放的数量，证实miR-4295/ARHGAP24轴促进了CTC释放；同时，项目组通过CCK8、Transwell、划痕及克隆形成实验验证了ARHGAP24抑制肝癌细胞增殖及侵袭。流式细胞术实验发现ARHGAP24参与诱导肝癌细胞凋亡及发生G0/G1期阻滞。免疫荧光、骨架染色及体内免疫组化实验揭示了ARHGAP24可逆转肝癌细胞的EMT表型。为探索ARHGAP24发挥抑癌作用的机制，项目组通过分析TCGA数据，结合KEGG、GSEA分析及TOP/FOP FLASH实验发现ARHGAP24抑制wnt/β-catenin信号通路的活化是肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的关键。进一步通过免疫沉淀结合质谱技术我们筛选出ARHGAP24发挥抑癌作用的关键下游分子PKM2。结合免疫共沉淀、体外泛素化实验系统性揭示了ARHGAP24可能通过抑制PKM2磷酸化，促进PKM2蛋白经泛素-蛋白酶体途径降解，进而抑制其在胞浆内的糖酵解功能及胞核中转录调控作用，研究结果为肝癌转移复发揭示新的机制和诊疗切入点，对提高我国肝癌治疗水平具有积极意义。为深入探索miR-4295/ARHGAP24轴的临床意义，我们成功分离并鉴定50例HCC及对照组（非HCC患者）血浆外泌体，证实肝癌患者血浆外泌体中miR-4295表达与肝癌患者预后不良相关；同时，通过对包含有189例肝癌组织的芯片进行免疫组化染色评估，发现肝癌患者ARHGAP24低表达可作为预测患者肿瘤复发（HR，0.28 [0.16-0.47]；P<0.001）或死亡（HR，0.22 [0.11-0.47]；P<0.001）的独立风险因子，上述研究结果提供了一种可靠的外周循环新型检测标志物，为未来肝癌患者综合管理提供了参考。