海洛因依赖小鼠伏隔核/海马/前额叶皮质中双重特异性磷酸酶关键基因的筛选及作用机制研究

To clarify the role of dual-specificity phosphatase (DUSPs) in heroin dependence, a comprehensive assessment is determined to establish the heroin dependence mice model. To find significant genetic differences between the case and control groups, the mRNA expression levels of DUSPs in the mesolimbic cortex system (NAc-Hip-PFC) are carried by Q-PCR. To screen the key genes, the protein expression levels of DUSPs are determined by Western blot and immune fluorescent. To clarify the role of key genes, the agonist/antagonist and Raav-DUSPs cloning lentivirus mice are employed in intervention study, then detect the expression of MAPK and its phosphorylation. To reveal the signaling mechanism of key genes, The MAPK signal pathway and its target proteins are detected by chip, then test the signal molecules and behaviors on different phases of DUSP-/- knockout mice ;To perfect the upstream and downstream of MAPK signaling, we employ the DRD1-/-/DRD3-/- mice. Finally, the expression of key genes and signal pathway are observed through simulating of methadone maintenance treatment. In summary, these results may provide experimental and theoretical basis for the prevention of heroin dependence and drug discovery.

为阐明双重特异性磷酸酶（dual-specificity phosphatases，DUSPs）在海洛因依赖中的作用。本研究构建海洛因依赖小鼠模型，对中脑边缘皮质系统（NAc-Hip-PFC）DUSP1-28基因进行Q-PCR检测，初步筛选脑区差异基因；通过对差异基因蛋白表达进行检测，进一步筛选发挥重要作用DUSPs基因；采用药理学及克隆慢病毒进行干预研究，检测MAPK表达及活化，筛选出DUSPs关键基因；对MAPK信号通路及其靶蛋白进行芯片检测，揭示DUSPs关键基因信号通路作用机制；采用小鼠DUSPs基因敲除模型，对依赖不同阶段行为学及信号分子进行检测，明确DUSPs关键基因信号传导机制；利用本实验室培育的小鼠多巴胺受体基因敲除模型，完善DUSPs在海洛因依赖中的上下游信号通路分子机制；模拟美沙酮维持治疗，观察关键基因及信号通路变化，为毒品依赖的防治和新药研发提供实验基础和理论依据。

海洛因依赖是一个很严重的公共健康和医学问题。伏隔核（nucleus accumbens，NAc）包括“愉悦中枢”，是奖赏-强化系统的主要组成部分，在人类和动物的行为奖赏、强化及药物依赖发生发展过程中起至关重要作用。介导MAPK去磷酸化的主要酶为双重特异性磷酸酶（dual-specificity phosphatases，DUSPs）超家族。通过药物降低MAPK活化程度是治疗药物依赖的潜在可行方案。我们发现吗啡成瘾小鼠NAc p-ERK上调。我们对吗啡成瘾小鼠NAc 核团的DUSPs家族21个基因的mRNA及蛋白进行了全面检测，结果发现小鼠经过CPP训练NAc DUSP15在吗啡成瘾和复吸阶段表达降低。通过脑立体定位微量注射技术，对DUSP15注射过表达病毒进行干预，发现上调DUSP15可以阻断复吸，并下调p-ERK，表明吗啡成瘾记忆引起的ERK去磷酸化机制是通过DUSP15实现。吗啡反复暴露小鼠NAc的p-ERK和DUSP15表达没有发生变化，但会引起焦虑样行为和空间记忆损伤，上调DUSP15不能改善焦虑样行为和空间记忆损伤。我们的研究表明，DUSP15在成瘾记忆形成中至关重要，是阻断药物复吸的关键因素，为治疗药物成瘾提供了重要的候选基因。.抑郁是阿片成瘾患者普遍存在的神经精神合并症。伏隔核（NAc）KOR（Kappa受体）在海洛因戒断性抑郁中起重要调控作用。然而，NAc投射环路KOR在海洛因戒断性抑郁中的研究尚未展开。项目通过糖水偏爱、强迫游泳等试验建立了小鼠戒断性抑郁模型；通过KOR、MOR、DOR蛋白筛选及FISH，明确了NAc 神经环路BLA→NAc及PVT→NAc。项目仍在探索研究中。