多乙烯基单体可控活性聚合方法构建基因载体及其在大包疹表皮松懈症治疗中的应用

Lack of high performance non-viral gene delivery vectors is the major hurdle of gene therapy in clinic. Previously, we have successfully conducted well-controlled homopolymerization of multivinyl monomers （MVMs）, which provides a new platform for the development of non-viral gene delivery vectors. Based on this platform, we have synthesized various highly branched polymers as well as single chain cyclized polymers, and used them as vectors for gene transfection. Results from a broad range of cell types such as human adipose derived stem cells (hADSC) and normal human keratinocytes (NHK) cells demonstrated that both types of polymers had much higher transfection and lower cytotoxicity compared to the commercially available SuperFect. In this project, we will focus on optimizing the composition and structure of the highly branched polymer and single chain cyclized polymer, modifying their functional molecules to conquer the core barriers of gene delivery including low cellular uptake of DNA complexes, slow endosomal escape, non-degradability of vectors thus to further improve the transfection efficiency and safety. RDEB graft and knockout mouse model will be used to evaluate the performance of highly branched polymers and single chain cyclized polymers in vivo. The understanding of the polymer structure/property and transfection efficiency/safety of the highly branched polymers and single chain cyclized polymers would enlighten the development of non-viral vectors, also will provide vectors for the treatment of RDEB.

缺乏高效的基因载体极大地限制了基因疗法的临床应用。我们课题组通过多乙烯基单体活性自由基聚合合成了新型超支化和单链超内环化两种结构不同的聚合物，为设计开发多功能载体提供了新平台。我们初步将这两种聚合物应用于基因转染，结果显示其能够高效地转染人脂肪干细胞等10余种细胞，转染效率均显著高于SuperFect等商业化试剂。在本项目中，我们拟在所得初步实验结果的基础上系统地优化聚合物组成和结构，并修饰改性拓展其性能，以克服基因转染过程中DNA复合物细胞摄取效率低、内涵体逃离困难以及载体不可降解等核心屏障，提高基因转染效率和安全性，并以大包疹表皮松懈症（RDEB）为疾病模型进行动物评价。本项目拟阐明的基于多乙烯基单体可控活性自由基聚合得到的超支化聚合物和单链超内环化聚合物的功能和性质，与其基因转染效率和安全性的关系，对非病毒基因载体开发具有重要的指导意义；同时能够发展出临床紧缺的RDEB基因治疗载体。

基因疗法尽管具有很大的临床应用潜力，但制约其向临床应用转化的核心瓶颈之一是缺乏安全而有效的非病毒基因载体。在本项目中，我们使用多乙烯基单体可控聚合方法，开发了一类高效而安全的非病毒基因载体，并尝试将其应用于大疱疹表皮松懈症（RDEB）的基因治疗。我们首先对多乙烯基单体可控聚合的机理进行的研究，在此基础上，我们使用逆向增强原子转移自由基聚合（DE-ATRP）及可逆加成断裂链转移自由基聚合（RAFT）等方法合成了一系列超支化聚合物及单链内环化聚合物，并对他们在DNA压缩、所形成的复合物纳米粒子的尺寸及电位、体外基因转染效率及安全性进行了系统评价。我们发现：1）经典的Flory-Stockmayor（F-S）理论适用于FRP聚合体系，但是不适用于可逆失活自由基聚合（RDRP）体系；2）各种可控聚合方法均能有效抑制或推迟多乙烯基聚合过程中凝胶点的出现，从而得到超支化聚合物或单链内环化聚合物，并且可对其组成和结构进行广泛调节；3）超支化聚合物和单链内环化聚合物可有效压缩DNA形成表面带正电荷的复合物纳米粒子；4）在多种细胞中，包括RDEB角质细胞，超支化聚合物和单链内环化聚合物均表现出比PEI和Lipofectamine高出1~2个数量级的基因转染效率和很低的细胞毒性。更为重要的是，超支化聚合物和单链内环化聚合物能有效递送编码胶原VII蛋白质的DNA（COL7A1）进入RDEB角质细胞中，恢复胶原VII蛋白的表达。这些结果证明，基于多乙烯基单体聚合所得到的超支化聚合物和单链内环化聚合物可作为一类安全而高效的非病毒基因载体体系，并有望为RDEB这类严重的遗传性皮肤基因疾病提供一种有效的基因治疗方法。